任芳 張尊平 范旭東 胡國君 李正男 董雅鳳

摘要

葡萄病毒B Grapevine virus B （GVB）是葡萄皺木復(fù)合病中栓皮病的病原，為開展抗GVB轉(zhuǎn)基因研究，本研究利用RTPCR技術(shù)克隆GVB外殼蛋白（coat protein， CP）基因，與植物表達(dá)載體pRI 101AN連接構(gòu)建植物表達(dá)載體pRIGVB CP。采用電擊轉(zhuǎn)化法將植物表達(dá)載體pRIGVB CP導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法將外源基因?qū)胛鞣綗煛?7B。共獲得16個(gè)煙草再生株系，PCR檢測其中3個(gè)株系為陽性，陽性株系播種獲得的64株T1代植株中有30株擴(kuò)增到目的條帶，陽性率為46.9%，表明目的基因GVB cp成功導(dǎo)入煙草并可成功遺傳到子代。28株T1代轉(zhuǎn)基因植株接種病毒進(jìn)行抗病性鑒定，其中有6株對接種病毒GVB具有抗性。

關(guān)鍵詞

葡萄病毒B； 外殼蛋白基因； 植物表達(dá)載體； 煙草； 遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號：

S 432.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017236

Construction of a plant expression vector of the Grapevine virus B

coat protein gene and transformation into Nicotiana tabacum

REN Fang， ZHANG Zunping， FAN Xudong， HU Guojun， LI Zhengnan， DONG Yafeng

（National Center for Eliminating Viruses from Deciduous Fruit Trees， Institute of Pomology，

Chinese Academy of Agricultural Sciences， Xingcheng 125100， China）

Abstract

Grapevine virus B （GVB） is the pathogen of grapevine corky bark disease in the rugose wood complex. In order to develop transgenic plants resistant to GVB， the coat protein （CP） gene of GVB was cloned and inserted into the plant expression vector pRI 101AN and the recombinant plant expression vector pRIGVB CP was constructed. The vector pRIGVB CP was transformed into Agrobacterium tumefaciens LBA4404 by electric shock process， and then introduced into Nicotiana occidentalis ‘37B by Agrobacteriummediated leaf disc transformation. Totally 16 regenerated tobacco strains were obtained in this study. PCR detection indicated that three stains were positive， and 46.9 percent of 64 T1 plants were positive by PCR detection， indicating that the target gene GVB cp was successfully introduced into the tobacco and successfully inherited to the progeny. The resistance of transgenic tobacco was identified by inoculating GVB into T1 transgenic plants. The results indicated that 6 out of 28 T1 transgenic plants showed resistance to GVB.

Key words

Grapevine virus B； coat protein gene； plant expression vector； tobacco； genetic transformation

葡萄Vitis vinifera L.是我國的重要水果之一，截至2015年其產(chǎn)量排名為我國水果產(chǎn)量的第四位[1]。但同時(shí)葡萄也是感染病毒種類最多的果樹，目前國內(nèi)外已報(bào)道65種病毒可侵染葡萄[2]，病毒病也逐漸成為制約我國葡萄產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的重要因素之一。葡萄栓皮?。╟orky bark， CB）是皺木復(fù)合?。╮ugose wood complex， RW）中的一種病害類型[3]，其病原為葡萄病毒B Grapevine virus B（GVB），為線性病毒科Flexiviridae葡萄病毒屬Vitivirus的重要成員[46]。目前GVB在美國、意大利[45]、法國、南非[6]、以色列[7]、印度[8]及中國[9]等全世界多個(gè)國家普遍發(fā)生，2014年對中國不同地區(qū)的188個(gè)葡萄樣品檢測發(fā)現(xiàn)其中17個(gè)樣品攜帶GVB，帶毒率為9%左右[9]。GVB感染葡萄后植株將終生帶毒，難以通過化學(xué)藥劑進(jìn)行有效防治，因此培育抗病品種是防控葡萄病毒病的重要途徑，利用基因工程導(dǎo)入外源基因是抗病育種的一種有效輔助手段。目前葡萄抗病毒基因工程主要利用病毒外殼蛋白（coat protein，CP）和移動蛋白（movement protein，MP）等病毒來源的基因作為抗性基因，并獲得了抗病毒植株[1011]。這一類基因誘導(dǎo)植株產(chǎn)生針對來源病毒的特異抗性。田莉莉等[1213]為創(chuàng)制針對葡萄病毒的廣譜抗病毒植物新材料，分別將2種和4種葡萄病毒部分cp基因片段串聯(lián)構(gòu)建RNAi干擾植物表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)入煙草和葡萄體細(xì)胞胚，抗性效果有待進(jìn)一步評價(jià)。除病毒源基因外，一些非病毒來源的基因也被應(yīng)用于抗病毒基因工程，如郭佩佩等[14]利用大豆凝集素基因lecs轉(zhuǎn)化煙草增強(qiáng)了植株對煙草花葉病毒Tobacco mosaic virus（TMV）的抗性；本實(shí)驗(yàn)室曾將一種廣譜性抗病毒基因酵母pac1基因?qū)霟煵?，所獲得的部分轉(zhuǎn)基因植株對GVB表現(xiàn)出一定的耐病性，但并不能完全抵抗病毒的侵染[15]，因此還需探索和研究誘導(dǎo)抗性更強(qiáng)的外源基因。利用病毒cp基因培育抗病毒植株已有一些成功案例[1011]，但由于轉(zhuǎn)基因葡萄植株培育、抗性評價(jià)等周期長、難度大，因此選擇煙草等模式植物開展轉(zhuǎn)基因研究，可快速獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株并進(jìn)行抗性評價(jià)，如RadianSade等[16]、Ling等[17]、JardakJamoussi等[18]將GVA 、GFLV、或GLRaV2等葡萄病毒cp或mp基因?qū)霟煵莴@得轉(zhuǎn)基因植株，通過摩擦接種轉(zhuǎn)基因煙草觀察癥狀表現(xiàn)快速進(jìn)行抗性評價(jià)，初步篩選出抗病或耐病株系。有關(guān)GVB cp基因的遺傳轉(zhuǎn)化研究目前國內(nèi)尚罕見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)室研究證明西方煙Nicotiana occidentalis‘37B接種GVB后，會出現(xiàn)明顯褪綠、黃化、皺縮畸形等癥狀[15]，有助于快速進(jìn)行抗病性評價(jià)，因此本研究將GVB cp基因作為目的基因?qū)朐摕煵荩瑸樵u價(jià)其抗病毒效果、培育抗性更強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

用于GVB cp基因克隆的毒源為GVB帶毒葡萄植株摩擦接種的西方煙N.occidentalis‘37B組培苗，由本實(shí)驗(yàn)室保存；用于遺傳轉(zhuǎn)化的健康西方煙‘37B組培苗由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 載體、菌株及主要試劑

大腸桿菌Escherichia coli DH5α感受態(tài)、農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciens LBA4404電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)、克隆載體pMD 19T、植物表達(dá)載體pRI 101AN、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、PCR相關(guān)試劑等均購自TaKaRa公司（大連）；質(zhì)粒提取試劑盒、植物基因組DNA提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司；6芐氨基腺嘌呤（6benzylaminopurine，6BA）、萘乙酸（naphthylacetic acid，NAA）、吲哚丁酸（indolebutyric acid，IBA）、鏈霉素（streptomycin，Sm）卡那霉素（kanamycin，Km）、頭孢霉素（cefotaxime sodium，Cef）等激素和抗生素購自美國Sigma公司。

1.3 GVB cp基因的克隆

根據(jù)GenBank登錄的GVB序列利用軟件Primer premier 5.0及Oligo 6.0設(shè)計(jì)擴(kuò)增GVB cp基因全長的引物：B8ABam（5′CAGGATCCTACGAGACAATAAGCAAGC3′），B8BSac（5′CCGAGCTCCACCCAAATACTTAGACATAC3′），上下游引物5′端分別添加Bam HⅠ和SacⅠ酶切位點(diǎn)。參照任芳等[19]的方法，從實(shí)驗(yàn)室保存的GVB毒源煙草組培苗中RTPCR擴(kuò)增cp基因，連接到pMD 19T載體，轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)，PCR篩選陽性克?。╬MDGVB CP）并進(jìn)行測序和酶切驗(yàn)證。采用DNAStar 7.0和MEGA 7.0.14 軟件進(jìn)行序列分析和比對。多序列比較采用DNAstar Clustal V方法。

1.4 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

植物表達(dá)載體構(gòu)建流程見圖1，利用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SacⅠ分別對pMDGVB CP質(zhì)粒和pRI 101AN載體雙酶切，膠回收目的基因片段和線性化載體大片段，T4 DNA連接酶連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，PCR篩選陽性克隆（pRIGVB CP）并進(jìn)行測序和酶切驗(yàn)證。提取pRIGVB CP質(zhì)粒DNA，利用美國BIORAD公司Gene Pulser XcellTM電穿孔系統(tǒng)電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)。轉(zhuǎn)化步驟：取20 μL感受態(tài)細(xì)胞置于冰上融化，加入2 μL質(zhì)粒DNA；將混合液加入冰中預(yù)冷的BIORAD 電極間距0.1 cm的電擊杯內(nèi)，2 400 V電擊2次；迅速置于冰上冷卻，然后加入1 mL SOC培養(yǎng)基，30℃ 120 r/min振蕩培養(yǎng)1 h；取適量菌液涂布于含卡那霉素（Km）100 mg/L和鏈霉素（Sm）100 mg/L的LB培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)48 h，挑斑培養(yǎng)，菌液PCR鑒定篩選陽性克隆。

1.5 煙草遺傳轉(zhuǎn)化及再生植株培育

參照任芳等[15]的葉盤法進(jìn)行煙草遺傳轉(zhuǎn)化，將含重組質(zhì)粒pRIGVB CP的農(nóng)桿菌菌液振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.6時(shí)低速離心收集沉淀，沉淀用MS液體培養(yǎng)基重懸作為侵染源。將煙草無菌組培苗葉片剪成0.5～1.0 cm2的小塊，在上述菌懸液中浸泡10 min，無菌濾紙吸干多余菌液，接種于分化培養(yǎng)基（MS+3.0 mg/L 6BA+0.2 mg/L NAA+100 μmol/L乙酰丁香酮）上27℃暗培養(yǎng)3 d，然后轉(zhuǎn)至含Km和Cef的選擇培養(yǎng)基（MS+3.0 mg/L 6BA+0.2 mg/L NAA+50 mg/L Km+250 mg/L Cef）于（25±2）℃、L∥D=16 h∥8 h條件下培養(yǎng)，每月繼代培養(yǎng)1次，誘導(dǎo)產(chǎn)生抗性芽，待不定芽長至1～2 cm時(shí)將其切下轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基（1/2MS+0.5 mg/L IBA+25 mg/L Km+150 mg/L Cef）誘導(dǎo)生根直至獲得完整再生植株。

1.6 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測

取再生植株葉片采用CTAB法提取基因組DNA，提取步驟參照北京艾德萊生物科技有限公司CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒說明書，采用引物B8ABam/B8BSac對DNA模板進(jìn)行PCR檢測，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。收集陽性T0代植株種子播種，培育T1代植株，同樣采用引物B8ABam/B8BSac進(jìn)行PCR檢測鑒定陽性植株。

1.7 轉(zhuǎn)基因植株抗病性初步鑒定

在轉(zhuǎn)基因T1代陽性植株6葉期左右，取感染GVB的試管苗毒源摩擦接種轉(zhuǎn)基因煙草，同時(shí)接種非轉(zhuǎn)基因煙草為對照，觀察轉(zhuǎn)基因植株及對照植株癥狀表現(xiàn)，在接種后15 d和30 d分別采集植株葉片提取總RNA，采用引物GVBh/GVBc（GVBh：5′ATCAGCAAACACGCTTGAACCG3′，GVBc：5′GTGCTAAGAACGTCTTCACAGC3′）進(jìn)行RTPCR檢測確定植株中帶毒情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 GVB cp基因的克隆

引物B8ABam/ B8BSac從實(shí)驗(yàn)室保存的毒源煙草中均擴(kuò)增到約704 bp的目的片段（圖2a）。克隆產(chǎn)物菌液PCR鑒定（圖2b）和Bam HⅠ和SacⅠ雙酶切鑒定（圖2c）表明成功獲得陽性克隆pMDGVB CP。陽性克隆經(jīng)測序共獲得11個(gè)GVB cp序列，包含完整GVB cp基因（594 bp）及兩端引物和酶切位點(diǎn)序列。這些cp基因克隆序列相似性達(dá)98.8%～100%，與GenBank登錄的GVB cp序列核苷酸相似性為77.9%～98.8%，其中與登錄號X75448分離物相似性最高，達(dá)97.5%～98.5%，在進(jìn)化樹上也聚在一個(gè)分支。本研究所獲得的11個(gè)克隆序列中僅有2個(gè)克隆序列共3個(gè)氨基酸差異，其余9個(gè)克隆均沒有氨基酸突變，并且其中有6個(gè)克隆氨基酸和核苷酸序列均完全一致，表明這些序列為優(yōu)勢序列，選取其中的克隆991作為載體構(gòu)建的目的片段。

2.2 植物表達(dá)載體pRIGVB CP構(gòu)建及轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

用BamHⅠ和SacⅠ分別對克隆質(zhì)粒pMDGVB CP和載體pRI 101AN進(jìn)行雙酶切、回收和轉(zhuǎn)化DH5α，克隆產(chǎn)物PCR擴(kuò)增除1個(gè)克隆未擴(kuò)增到目的條帶外其余克隆均獲得目的條帶（圖3a）。陽性克隆質(zhì)粒DNA雙酶切鑒定獲得兩條條帶，其中小片段為cp基因，大片段為切下的載體片段（圖3b）。陽性克隆測序結(jié)果顯示未發(fā)生堿基突變，表明植物表達(dá)載體pRIGVB CP構(gòu)建成功。將植物表達(dá)載體pRIGVB CP質(zhì)粒DNA電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，克隆產(chǎn)物PCR擴(kuò)增獲得約704 bp的目的條帶，表明載體成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌（圖3c）。

2.3 煙草遺傳轉(zhuǎn)化及再生植株培育

含植物表達(dá)載體pRIGVB CP的農(nóng)桿菌共浸潤煙草葉盤（圖4a），暗培養(yǎng)3 d后轉(zhuǎn)入含Km和Cef的選擇培養(yǎng)基上誘導(dǎo)培養(yǎng)，約4周后開始產(chǎn)生抗性不定芽（圖4b）。待不定芽長至1～2 cm時(shí)切下不定芽轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根（圖4c），成功獲得完整再生植株（圖4d）。在Km和Cef篩選下共獲得再生煙草16株。

2.4 轉(zhuǎn)基因煙草的PCR鑒定

采用引物B8ABam/ B8BSac對16株再生煙草植株的PCR鑒定結(jié)果表明，其中有3株擴(kuò)增到約704 bp的目的條帶，陰性對照和其余植株未擴(kuò)增到目的條帶（圖5）。收集陽性T0代植株種子播種，對3個(gè)陽性株系共64株T1代植株進(jìn)行PCR檢測，其中30株擴(kuò)增到目的條帶，陽性率46.9%，表明目的基因GVB cp基因成功導(dǎo)入煙草并可成功遺傳到子代植株。

2.5 轉(zhuǎn)基因煙草抗病性初步鑒定

在轉(zhuǎn)基因T1代陽性植株6葉期左右接種GVB毒源，共接種28株，同時(shí)接種10株非轉(zhuǎn)基因煙草為對照。接種后15 d，所有非轉(zhuǎn)基因植株新葉均出現(xiàn)褪綠、黃化、皺縮畸形及葉片變小等癥狀，接種的轉(zhuǎn)基因T1代陽性植株中有22株出現(xiàn)與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障嗨频陌Y狀，另外有6株未觀察到明顯癥狀（圖6）。分別提取轉(zhuǎn)基因T1代接種后無癥狀植株（6株）、轉(zhuǎn)基因T1代接種發(fā)病植株（4株）、非轉(zhuǎn)基因接種發(fā)病植株（4株）及非轉(zhuǎn)基因未接種健康植株（2株）總RNA，采用引物GVBh/GVBc進(jìn)行RTPCR檢測。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因T1代接種發(fā)病植株和非轉(zhuǎn)基因接種發(fā)病植株中均擴(kuò)增到GVB目的條帶，轉(zhuǎn)基因T1代接種后無癥狀植株及非轉(zhuǎn)基因未接種健康植株中均未擴(kuò)增到GVB目的條帶（圖7）。接種后30 d再次采集相同植株葉片，RTPCR檢測GVB帶毒情況與接種15 d結(jié)果一致。因此，接種及檢測表明無癥狀的6株轉(zhuǎn)基因T1代植株中未被GVB侵染，初步表明其對GVB具有一定的抗性。

3 討論

葡萄為多年生木本植物，生長周期長且再生困難，近年來與大田作物相比葡萄抗病毒基因工程進(jìn)展相對緩慢。由于在葡萄上進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株培育、抗性評價(jià)等周期長、難度大，因此多項(xiàng)研究選擇煙草等模式植物進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株培育和抗性評價(jià)[1618，20]。已有研究獲得導(dǎo)入GVA cp、GFLV mp、GLRaV2 cp等葡萄病毒基因的轉(zhuǎn)基因煙草，通過病毒接種及癥狀表現(xiàn)發(fā)現(xiàn)它們對同源病毒普遍具有抗性，抗性表現(xiàn)分為抗?。ㄖ仓暝谡麄€(gè)試驗(yàn)期間均無癥狀）或耐病（植株發(fā)病延遲或癥狀減弱）等類型[1618]。本實(shí)驗(yàn)室此前獲得的酵母pac1轉(zhuǎn)基因煙草部分株系經(jīng)病毒摩擦接種后也表現(xiàn)出癥狀延遲和減弱等耐病性，但仍可在植株體內(nèi)檢測到病毒存在，表明不能完全抵抗病毒侵染[15]。本研究成功構(gòu)建了GVB cp基因植物表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化成功導(dǎo)入煙草獲得轉(zhuǎn)基因植株。但目前轉(zhuǎn)化效率較低，陽性率僅為18%，可能與載體及菌株類型、受體材料狀態(tài)及培養(yǎng)條件等原因有關(guān)。陽性株系播種獲得的T1代植株中，陽性率達(dá)46.9%，表明目的基因可成功遺傳子代，且通過T1代植株接種病毒進(jìn)行抗病性鑒定表明，其中有6株對接種病毒GVB具有抗性，表明該轉(zhuǎn)基因策略可成功獲得抗性植株。在今后試驗(yàn)中將通過增加抗生素濃度及繼代培養(yǎng)次數(shù)等途徑提高轉(zhuǎn)化率，并進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株擴(kuò)繁培育以及葡萄遺傳轉(zhuǎn)化研究，為培育抗病毒植株、開展葡萄抗病毒分子輔助育種提供一定基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：田 喆）