程李莉 江幸福 程云霞 劉悅秋 張蕾 羅禮智

摘要

為明確黏蟲咽側(cè)體抑制神經(jīng)肽基因（allatostatin， AST）在調(diào)控黏蟲Mythimna separata （Walker） 保幼激素（juvenile hormone， JH）中的功能，采用RTPCR和RACE技術(shù)克隆獲得的黏蟲AST基因cDNA全長序列902 bp，開放閱讀框378 bp，編碼125個氨基酸。蛋白分子量為14.33 kD，等電點為9.25，具有C型AST典型的PISCF序列。進化樹分析表明，黏蟲AST氨基酸序列與一點黏蟲、草地貪夜蛾、棉鈴蟲氨基酸序列相似性高達80%以上。實時熒光定量PCR結(jié)果表明AST在成蟲期的表達有明顯組織和時間特異性。AST在飛行肌中表達量最高，頭部其次，卵巢最低；黏蟲頭部AST表達量在7日齡最高，飛行肌中AST基因的表達量在1日齡最高。本研究對進一步揭示黏蟲AST基因?qū)H調(diào)控作用，明確黏蟲JH調(diào)控遷飛和生殖的相關(guān)的分子調(diào)控機制具有重要意義。

關(guān)鍵詞

黏蟲； 咽側(cè)體抑制素； 克??； 表達

中圖分類號：

Q 965

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017179

Cloning and expression analysis of allatostatin gene in adults of the

oriental armyworm， Mythimna separata （Walker）

CHENG Lili1， JIANG Xingfu1， CHENG Yunxia1， LIU Yueqiu2， ZHANG Lei1， LUO Lizhi1

（1. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant Protection， Chinese Academy of

Agricultural Sciences， Beijing 100193， China； 2. Beijing University of Agriculture， Beijing 102206， China）

Abstract

In order to clarify the role of the allatostatin gene （AST） in the process of juvenile hormone synthesis and release of Mythimna separata （Walker）， the AST gene of M.separata was cloned by RTPCR and RACE.The full length of cDNA was 902 bp， which contained a 378 bp open reading frame （ORF） encoding 125 amino acid residues with a molecular mass of 14.33 kD and a theoretical isoelectric point of 9.25. The typical structure of Ctype AST （PISCF） was located in the deduced amino acid sequence. Phylogenetic analysis indicated that AST protein of M.separata had a high similarity （up to 80%） to those of Pseudaletia unipuncta， Spodoptera frugiperda and Helicoverpa armigera. The qRTPCR analysis showed that the expression levels of AST gene were significantly different at different stages and in various tissues of the female M.separata， mostly expressed in flight muscle and head， weakly expressed in the ovary. The expression was the highest in the head at 7 d but in flight muscle at 1 d. This study has a significance in enriching our knowledge about the function of AST on JH and the molecular mechanism of JH during flight and reproduction in M.separata.

Key words

Mythimna separata； allatostatin； cloning； expression

保幼激素（juvenile hormone， JH）是一種由昆蟲咽側(cè)體所分泌的倍半萜類化合物，對昆蟲的變態(tài)、生殖和發(fā)育起到重要的調(diào)控作用。在幼蟲期，阻止蛻皮激素引起的變態(tài)，維持幼蟲的結(jié)構(gòu)特征，成蟲期能促進卵子的發(fā)生、卵巢的發(fā)育和成熟[12]。研究表明，昆蟲體內(nèi)的JH受合成和代謝兩種途徑控制。其中，咽側(cè)體（corpora allata， CA）合成JH的活性受腦神經(jīng)細胞產(chǎn)生的神經(jīng)肽調(diào)控[3]，分別是促進咽側(cè)體分泌保幼激素的促咽側(cè)體神經(jīng)肽（allatotropin， AT）和抑制咽側(cè)體活性的AST （allatostatin， AST）[46]。AST由腦神經(jīng)細胞分泌，通過神經(jīng)、體液途徑傳遞到咽側(cè)體抑制保幼激素的合成與釋放[7]，AST對咽側(cè)體的抑制作用與昆蟲種類、發(fā)育階段有關(guān)。體外合成的AST多肽可以抑制鱗翅目昆蟲煙芽夜蛾Heliothis virescens的咽側(cè)體合成保幼激素，而對不完全變態(tài)昆蟲血黑蝗Melanoplus sanguinipes無影響[8]；煙芽夜蛾羽化后24 h雌成蟲的AST多肽顯著抑制羽化后3 d的雌成蟲咽側(cè)體合成保幼激素的能力[9]。但AST在昆蟲中的功能還不僅限于此，太平洋折翅蠊Diploptera punctata中腸中的AST可以刺激中腸酶的活性，后腸中的AST與其調(diào)節(jié)促肌蛋白的合成有關(guān)[10]。

目前，已分離鑒定出AST的昆蟲有家蠶、小菜蛾、黑脈金斑蝶、草地貪夜蛾、水稻二化螟等，按照其氨基酸序列碳端不同結(jié)構(gòu)可以將AST分為3類：（1）A型碳末端有同一酰胺化氨基酸序列Y/FXFGL[11]；（2）B型碳末端有一個酰胺化的W（X）序列[1213]；（3）C型碳末端氨基酸未經(jīng)酰胺化[14]，該型咽側(cè)體抑制素N末端具有環(huán)化阻礙結(jié)構(gòu)，C末端含有未環(huán)化的PISCF序列，且在兩個內(nèi)部的半胱氨酸之間有1個二硫橋[15]。

黏蟲Mythimna separata （Walker）屬鱗翅目，夜蛾科，是一種典型的長距離遷飛害蟲。主要在亞洲、大洋洲近30個國家發(fā)生為害，我國除新疆外均有分布。黏蟲的寄主種類達16科100多種，除為害禾本科作物和牧草外，還給經(jīng)濟和油料作物造成重大損失。建國后我國黏蟲多次暴發(fā)成災(zāi)，1950-1989年全國性黏蟲暴發(fā)成災(zāi)17年，成災(zāi)面積7 191萬hm2，造成糧食損失1 600多萬t[16]。2012年，三代黏蟲在東北等地大面積暴發(fā)成災(zāi)，發(fā)生927.99萬hm2，損失糧食65.79萬t。前期研究發(fā)現(xiàn)，保幼激素對黏蟲的遷飛、生殖和發(fā)育具有重要調(diào)控作用。黏蟲成蟲遷飛時保幼激素和卵巢發(fā)育水平較低，保幼激素水平升高后卵巢成熟，飛行能力下降，且黏蟲遷入種群表現(xiàn)為保幼激素水平高，卵巢發(fā)育級別高，飛行能力較弱[1718]；黏蟲點滴保幼激素后飛行能力減弱，而生殖能力增強[19]；羽化后1日齡是保幼激素調(diào)控遷飛和生殖的關(guān)鍵期，黏蟲1日齡飛行可以刺激咽側(cè)體活性促進保幼激素的合成與釋放[20]，對1日齡黏蟲進行饑餓處理使得其保幼激素提前分泌，促進卵巢發(fā)育[2122]。由此可見，保幼激素和黏蟲的遷飛與生殖密切關(guān)聯(lián)，而與保幼激素相關(guān)的分子調(diào)控途徑的研究將為揭示黏蟲遷飛致災(zāi)的調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。為了進一步明確保幼激素在調(diào)控黏蟲遷飛和生殖中的分子調(diào)控途徑，本研究對調(diào)控保幼激素合成的黏蟲AST基因開展研究。通過利用RACE技術(shù)克隆得到黏蟲AST基因全長，實時熒光定量技術(shù)分析其在黏蟲體內(nèi)的時空表達情況，對進一步研究保幼激素調(diào)控黏蟲飛行與生殖的內(nèi)在分子調(diào)控機制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

供試昆蟲：蟲源來自田間采集的越冬代黏蟲成蟲，經(jīng)室內(nèi)繁殖3、4代供試。幼蟲用30～50 cm長的玉米葉飼養(yǎng)，飼養(yǎng)密度為10頭/瓶，溫度為（24±1）℃，光周期為L∥D=14 h∥10 h，相對濕度為70%左右。飼養(yǎng)方法參照呂偉祥等[23]的室內(nèi)人工飼養(yǎng)方法，每日更換新鮮玉米葉，直至幼蟲停止取食為止。幼蟲老熟時，在玻璃瓶內(nèi)加入含水量10%～15%的土粒供其化蛹。成蟲羽化后雌雄配對放置于直徑8 cm，高20 cm的塑料罩中并喂飼5%的新鮮蜂蜜水，每日更換。

主要試劑：RNA提取試劑TRIzol Reagent購于美國Invitrogen公司、瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒、DNA連接試劑盒、5′Full RACE Kit試劑盒購于TaKaRa公司、FastQuant RT Kit （with gDNase）反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SuperReal PreMix Plus （SYBR Green）實時熒光定量試劑盒購于北京天根生化科技有限公司。所有引物合成與DNA測序由上海生工生物工程股份有限公司完成。大腸桿菌感受態(tài)細胞JM109購于TaKaRa公司、克隆載體pMD20T購于天為時代公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)黏蟲近緣種一點黏蟲Pseudaletia unipuncta基因序列，GenBank序列號為U36570.1，參照保守區(qū)域結(jié)合PCR引物設(shè)計原則，設(shè)計簡并引物，根據(jù)同源序列設(shè)計3′RACE引物和5′RACE引物，擴增得到基因的3′端序列和5′端序列。由得到的黏蟲AST序列，設(shè)計1對熒光定量引物ASTqF/ASTqR，以βactin基因[24]（登錄號：GQ856238.1）作為內(nèi)參基因（表1）。

1.2.2 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

解剖黏蟲成蟲腦組織、飛行肌、卵巢置于無RNA酶離心管中，用液氮冷凍后用Trizol提取各組織RNA后溶于DEPC水，RNA用核酸蛋白檢測儀檢測其濃度和純度，用1.5%瓊脂糖凝膠檢測其完整性，參照FastQuant RT Kit （with gDNase）反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA第一鏈，并保存于-80℃以備使用。

1.2.3 黏蟲AST基因全長cDNA序列克隆及重組質(zhì)粒構(gòu)建

以獲得的cDNA產(chǎn)物為模板，利用上述設(shè)計的引物（CTE579 F、CTE579 R）擴增同源序列；由上述得到的同源序列，結(jié)合3′RACE引物設(shè)計原則設(shè)計引物（CTE605 3′），和5′RACE引物設(shè)計原則設(shè)計引物（CTE605 5′），分別克隆獲得基因的3′和5′端序列。PCR反應(yīng)程序設(shè)置為：94℃預(yù)變性3 min；然后30個循環(huán)，循環(huán)條件為94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min 30 s；最后72℃延伸10 min。

上述各PCR擴增片段進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收后使用連接酶與pMD20T載體連接后，熱轉(zhuǎn)化至E.coli Competent Cells JM109中，涂布平板，37℃過夜培養(yǎng)。藍白斑篩選，挑選陽性菌落，提取質(zhì)粒并測序。然后將所得序列片段拼接得到cDNA全長序列。由所得cDNA序列設(shè)計引物（CTE605 F、CTE605 R）進行PCR擴增，用于驗證開放閱讀框。

1.2.4 AST基因序列分析與系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

利用ORF Finder （http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/）查找完整的開放閱讀框，并推導(dǎo)出相應(yīng)的氨基酸序列。利用NCBI Blastx進行氨基酸序列相似性搜索。使用在線軟件SignalP4.1 Server（http：∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進行信號肽預(yù)測。序列比對使用DNAMAN軟件；利用ClustalX軟件進行氨基酸序列多重比較，采用MEGA 5.0鄰位相接法（neighbor joining， NJ）進行1 000次重復(fù)分析構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.5 實時熒光定量PCR反應(yīng)

以1、3、5和7日齡黏蟲雌蛾的頭部、飛行肌、卵巢的cDNA為模板，采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測羽化后不同時間各組織內(nèi)AST的表達水平，以1日齡頭部的表達量為參照，每個處理分別設(shè)置4個生物學(xué)重復(fù)。

實時熒光定量采用SYBR Green法，20 μL體系：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL；上、下游引物（10 μmol/L）各0.6 μL；50×ROX Reference Dye 0.4 μL；cDNA模板2 μL；加ddH2O補齊至20 μL。該反應(yīng)在ABI 7500 Realtime PCR儀中進行；反應(yīng)條件設(shè)置為：95℃預(yù)變性15 min；然后40個循環(huán)，循環(huán)條件為95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸32 s。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

黏蟲AST基因在不同發(fā)育階段和組織的轉(zhuǎn)錄水平利用2-△△Ct法分析，不同發(fā)育階段和組織AST的相對表達量采用SAS 5.0軟件進行Oneway ANOVA方差分析，多重比較采用Tukeys HSD法，差異顯著性檢驗水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 黏蟲AST片段的克隆與序列分析

2.1.1 黏蟲AST片段的克隆

以黏蟲腦組織cDNA為模板，擴增得到一條特異性同源序列條帶，通過3′RACE和5′RACE反應(yīng)分別得到長度為388 bp的3′端和224 bp的5′端，該基因被命名為黏蟲AST基因，GenBank登錄號為JQ669383.1。

2.1.2 黏蟲AST基因序列分析

AST基因cDNA序列全長共902 bp，并具有真核生物典型的polyA加尾信號AATAAA。該基因開放閱讀框為378 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，共編碼125個氨基酸。預(yù)測的蛋白分子量為14.33 kD，等電點為9.25，N末端含有1個由26個氨基酸組成的信號肽，屬于C型咽側(cè)體抑制素，含有保守的未環(huán)化C末端PISCF，內(nèi)部包含兩個半胱氨酸可以形成穩(wěn)定的二硫橋結(jié)構(gòu)，含有1個蛋白激酶磷酸化位點（TIR23-25）。對比AST編碼區(qū)cDNA的序列，其同源性經(jīng)過NCBI上BLAST分析，與一點黏蟲Pseudaletia unipuncta（GenBank登錄號：U36570.1）同源性達95%，和棉鈴蟲Helicoverpa armigera（GenBank登錄號：KC340915.1）同源性達87%，與臍橙螟蛾Amyelois transitella（GenBank登錄號：XM_013331392.1）和柑橘鳳蝶Papilio xuthus（GenBank登錄號：XM_013309172.1）的同源性達77%以上，比對結(jié)果證明該基因為黏蟲AST基因。

2.2 氨基酸序列相似性及進化樹分析

推導(dǎo)得到的黏蟲AST（GenBank登錄號： AFI56408.1）編碼的氨基酸序列與其他昆蟲氨基酸序列比對結(jié)果表明，該氨基酸序列與一點黏蟲（GenBank登錄號：AAA93257.1）氨基酸序列的一致性最高，達到99.2%；與棉鈴蟲（GenBank登錄號：AGH25547.1）、草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda （GenBank登錄號：Q868F8.1）、二化螟Chilo suppressalis （GenBank登錄號：ALM30301.1）具有較高的序列一致性，分別為87.2%、85.6%、61.6%；與家蠶Bombyx mori （GenBank登錄號：NP_001124356.1）和小菜蛾P(guān)lutella xylostella （GenBank登錄號：XP_011549721.1）的序列一致性較低，分別為52.8%和44.8%（圖3）。序列比對分析結(jié)果表明，C型AST普遍存在于鱗翅目昆蟲中，不同昆蟲AST氨基酸序列存在共同保守區(qū)域PISCF，并且兩個半胱氨酸形成了AST中唯一一對鏈內(nèi)二硫鍵。

進化樹分析顯示，黏蟲AST基因與一點黏蟲的親緣關(guān)系最近，與棉鈴蟲、草地貪夜蛾、分月扇舟蛾Clostera anastomosis （AEM44668.1）的親緣關(guān)系較近，與玉帶鳳蝶Papilio polytes （XP_013145137.1； XP_013145138.1）、柑橘鳳蝶（XP_013164626.1）、黑脈金斑蝶Danaus plexippus （EHJ74863.1）、臍橙螟蛾（XP_013186846.1）、小菜蛾、家蠶、二化螟的親緣關(guān)系較遠，而與埃及伊蚊Aedes albopictus（JAC07495.1）、擬果蠅Drosophila simulans （GenBank登錄號：XP_016024602.1）、冬尺蠖Operophtera brumata （KOB78759.1）的親緣關(guān)系最遠（圖4），總體趨勢是親緣關(guān)系越近，同源性越高，與氨基酸序列比對結(jié)果基本一致。

2.3 黏蟲AST基因的時序差異性表達

采用實時熒光定量PCR，從羽化后1～7日齡黏蟲的頭、飛行肌和卵巢中均檢測到AST基因的表達，但其表達情況隨組織和發(fā)育時間的不同而有明顯的差異。整體而言，AST在組織中的表達情況為飛行肌>頭部>卵巢。首先，黏蟲AST基因的表達具有明顯的組織分布表達特異性（F2，9=26.53，P<0.01；F2，8=62.55，P<0.01；F2，9=112.14，P<0.01）。

在羽化后1、3、5齡黏蟲飛行肌中AST的表達量均顯著高于頭部和卵巢（P<0.05），但頭部和卵巢之間無顯著性差異（P>0.05）。羽化后7日齡飛行肌AST基因的表達量顯著高于卵巢和頭部的表達量，且頭部表達量也顯著高于卵巢AST的表達（F2，9=13.48， P<0.01）。其次，黏蟲頭部AST基因在羽化后不同時間內(nèi)的表達量差異顯著（F3，11=4.53， P<0.05）；羽化后7日齡頭部的相對表達量最高且顯著高于羽化后5日齡（P<0.05），但和其他日齡差異不顯著（P>0.05）。羽化后不同日齡飛行肌中AST基因的表達量也存在顯著性差異（F3，12=9.63， P<0.01），羽化后1日齡AST基因的表達量最高，顯著高于羽化后5日齡和7日齡（P<0.05），但和羽化后3日齡差異不顯著（P>0.05）；卵巢中AST基因的表達量較低，且不同日齡之間的表達量無顯著性差異（F3，12=0.49， P>0.05）。

3 討論

AST是昆蟲體內(nèi)重要神經(jīng)肽激素，與昆蟲咽側(cè)體合成釋放保幼激素的活性密切相關(guān)[25]，除此之外還參與昆蟲體內(nèi)能源物質(zhì)的積累以及中腸的蠕動等生命活動。本研究通過RTPCR和RACE技術(shù)從黏蟲的腦部克隆獲得AST基因全長序列，并預(yù)測其蛋白分子量為14.33 kD，等電點為9.25，N末端含有1個由26個氨基酸組成的信號肽，該基因?qū)儆贑型AST，含有保守的未環(huán)化C末端PISCF，氨基酸序列內(nèi)部的兩個半胱氨酸可以形成穩(wěn)定的二硫橋結(jié)構(gòu)。NCBI BLAST分析結(jié)果表明該基因核酸序列與一點黏蟲、棉鈴蟲、臍橙螟蛾、柑橘鳳蝶的相似性達80%以上，親緣關(guān)系高度接近。由該基因序列推導(dǎo)的氨基酸序列，經(jīng)進化樹分析與一點黏蟲、棉鈴蟲、草地貪夜蛾親緣關(guān)系最近，氨基酸序列比對結(jié)果顯示高度同源，達到85%以上。以上結(jié)果表明本試驗克隆獲得的黏蟲AST基因?qū)儆诶ハxAST基因家族成員之一。

實時熒光定量PCR結(jié)果顯示：AST廣泛存在于黏蟲的各種組織中，包括腦、飛行肌、卵巢，但是其在不同發(fā)育時期和不同組織的表達量不同。羽化后1～5 d AST在頭部的表達量較低，7 d時出現(xiàn)升高，且與1、3、5 d有顯著性差異。研究表明遷飛型黏蟲一般在羽化后第5天開始產(chǎn)卵[26]，因此羽化后1～5 d是黏蟲卵巢發(fā)育與卵黃原蛋白形成時期，此時期AST的表達量較低；羽化后第7天黏蟲卵巢發(fā)育成熟產(chǎn)卵行為發(fā)生后，AST在黏蟲頭部的表達量上升，且顯著高于產(chǎn)卵前期時的表達量，推測黏蟲頭部AST基因的表達量變化與其生殖周期有關(guān)，這與AST在太平洋折翅蠊中的表達類似[27]。有關(guān)研究表明黏蟲羽化后1～5 d時咽側(cè)體活性呈上升趨勢，并于羽化后第5天出現(xiàn)最大值后下降[20]；黏蟲羽化后血淋巴內(nèi)保幼激素滴度與頭部AT表達量變化一致，羽化初期黏蟲頭部AT的表達量和保幼激素滴度較低，隨著羽化后時間的增加AT的表達量和保幼激素Ⅱ滴度呈上升狀態(tài)，并于羽化后第5天出現(xiàn)最大值[28]后呈下降趨勢，黏蟲頭部AT基因的表達量、咽側(cè)體活性和保幼激素滴度的變化均與頭部AST基因的表達量變化相反。由此推測：黏蟲羽化后1～5 d，頭部AT表達量較高而AST表達量較低，刺激了咽側(cè)體活性，促進保幼激素的合成與釋放，致使體內(nèi)保幼激素滴度較高，利于生殖系統(tǒng)發(fā)育和卵黃原蛋白的合成，卵母細胞吸收卵黃原蛋白，以及卵母細胞的成熟[2]；黏蟲羽化后第7天產(chǎn)卵后，生殖系統(tǒng)對于保幼激素的需求量較低，自身通過升高AST的表達量，同時降低AT的表達量，抑制咽側(cè)體釋放保幼激素的活性，致使體內(nèi)保幼激素滴度降低。以上研究表明黏蟲可以根據(jù)自身發(fā)育需要通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵基因的表達量來調(diào)控保幼激素水平，從而達到維持影響遷飛和生殖的目的。

飛行肌中AST在黏蟲羽化初期表達水平最高，隨著羽化時間呈下降趨勢。羽化初期黏蟲處于幼嫩期，飛行系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟時飛行肌中AST的表達量較高，隨著發(fā)育時間，黏蟲飛行能力逐漸增強飛行肌中AST的表達量保持較低水平，AST的表達量與飛行能力呈一定負相關(guān)，推測飛行肌中AST可能參與抑制黏蟲的飛行。曾有研究指出AST可以抑制太平洋折翅蠊肌肉的收縮[29]，AST是否參與抑制黏蟲飛行肌肌肉收縮還有待進一步研究。AST的廣泛分布反映了其功能的多樣性，但是目前僅探究了AST在頭部、中腸、后腸的功能，而本試驗中黏蟲的空間表達結(jié)果表明黏蟲內(nèi)主要表達部位是頭部和飛行肌，卵巢中的表達相對較少，且試驗所選4個日齡飛行肌中的表達量均遠遠高于頭部和卵巢，亟須進一步探究AST在黏蟲飛行肌的功能。

本研究克隆得到了黏蟲AST基因cDNA序列全長，分析明確了該基因的序列特征，并從mRNA水平檢測了該基因在黏蟲雌蛾體內(nèi)的時空表達模式。該研究結(jié)果為利用RNAi技術(shù)進一步研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)，豐富了影響?zhàn)はx遷飛和生殖的JH相關(guān)調(diào)控理論。

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（責任編輯：田 喆）