楊德廉 李祥英 馬夙靜 趙文超 王大海 管恩森 張英華 孟慶宏 劉振宇

摘要：為實現(xiàn)煙田土壤保育的目標，對長年連作的煙田施用有機肥，采用高通量測序技術，應用Solexa基因組分析平臺，測定和分析復合有機肥OFN、OFJ和煙草秸稈有機肥TS對煙田土壤細菌多態(tài)性的影響。結果表明，相對于單施化肥，煙田施用有機肥后，煙田土壤細菌OTU、chaol指數(shù)和ace指數(shù)增大，表明有機肥提高了煙田土壤細菌物種豐富度：細菌豐富度因有機肥種類而不同，并隨煙草發(fā)育期而產(chǎn)生差異。有機肥對土壤細菌菌群結構影響顯著，在門和屬的分類水平上，土壤優(yōu)勢細菌種類和比例產(chǎn)生明顯改變，特別是有機肥處理可顯著提高假絲酵母屬細菌的豐度，而降低紅色桿菌屬、硝化螺旋菌屬細菌的豐度。KEGG代謝途徑差異分析發(fā)現(xiàn)，施用有機肥后土壤細菌代謝路徑和代謝路徑中基因數(shù)量發(fā)生改變，而改變了煙田土壤細菌群落功能和細菌代謝?？傊瑹熖锸┯糜袡C肥改變了土壤細菌的多態(tài)性，并可能達到煙田土壤保育的效果。

關鍵詞：煙田；有機肥；土壤細菌；細菌多態(tài)性；土壤保育

煙草生產(chǎn)中存在長期連作且偏重施用化學肥料的現(xiàn)象，導致土層板結，肥力下降，土壤微生物多樣性減少，微生物種群趨向單一。土壤微生物在土壤生態(tài)系統(tǒng)中具有重要作用，質量好的土壤微生物多態(tài)性結構合理，對土壤有機物分解、腐殖質增加、團粒結構形成、速效養(yǎng)分釋放和累積、土壤結構改善具有重要意義。土壤微生物多態(tài)性反映土壤微生物在其物種豐富度及其種間差異，從一個側面反映了其群落結構的穩(wěn)定性，是評價土壤質量重要指標。

施用有機肥是土壤改良的重要手段。研究表明有機肥對良好的土壤結構有著促進作用，可提高土壤的pH值、速效養(yǎng)分的含量，促進植物對養(yǎng)分的吸收，提高作物的產(chǎn)量和質量。有機肥中含有大量易被微生物分解利用的物質，可以刺激微生物迅速生長增殖，顯著增加土壤微生物生物量，提高土壤微生物中碳、氮含量以及土壤酶活性，影響土壤微生物多態(tài)性。

本研究選取了兩種復合有機肥和煙草秸稈有機肥施用于連作煙田，采用高通量測序的方法，探討施用有機肥后連作煙田土壤細菌多態(tài)性特征，以明確不同有機肥對土壤的改良作用。

1材料與方法

1.1試驗地點

試驗于2015年在山東諸城煙草試驗站開展。試驗站位于山東省諸城市賈悅鎮(zhèn)瑯埠村，土壤類型為褐土，土壤基本養(yǎng)分狀況為：pH 6.25，有機質15.17 g/kg、全氮636.0 mg/kg、堿解氮63.07 mg/kg、速效磷30.23 mg/kg、速效鉀254.66 mg/kg、水溶性氯28.87 mg/kg、交換性鈣6455.78 mg/kg、交換性鎂118.59 mg/kg。該煙田多年連作，長年單一施用化學肥料。

1.2試驗設計

采用大田試驗共設3個有機肥處理，以單施化肥作為對照，共4個處理，隨機區(qū)組設計，重復3次。每個小區(qū)長×寬為50 mX6.6 m，以110 cmX55 cm株行距種植煙草6行。供試煙草品種為NC55。具體施肥方案設置如表1：各肥料中養(yǎng)分質量分數(shù)如表2。

1.3試驗方法

1.3.1土壤取樣方法在煙草平預期、采烤前期、采烤后期3個時期，沿每個處理的中間兩行煙壟，按“S”型方法在小區(qū)的5m、25m、45m處進行土壤取樣。選取健康煙株，在距煙草根莖15-20cm處，取10-20cm深度土壤。每個小區(qū)取3個樣，每個處理共取9個樣品，用無菌樣品袋保存，冰盒攜帶，放入-70℃冰箱保存，備用。

1.3.2土壤總DNA的提取和高通量測序DNA提取前將每個處理的9個樣品充分混勻為一個混合樣，4個處理的3次取樣共混合為12個樣品，采用Omega試劑盒提取土壤DNA，樣品檢測合格后，應用Solexa基因組分析平臺進行擴增子測序，測序為細菌16S rDNA的v3-v4雙可變區(qū)域。

1.3.3測序結果分析將原始測序數(shù)據(jù)去除接頭序列，并將雙端測序序列進行拼接成單條序列。對每個樣板庫的單序列基于GreenGene數(shù)據(jù)庫，使用QIIME（version 1.8.0）工具包進行注釋，按照97%的相似性閾值將序列劃分為不同的OTU（0perational Taxonomic Units），每一個OTU通常被視為一個微生物物種，并對樣本數(shù)據(jù)進行豐富度指數(shù)計算、PCA（Princjpal Component Analysis）差異性分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes）構成差異分析。

2結果

2.1有機肥對煙田土壤細菌群落豐富度的影響

從12個土壤樣品中共獲得1167815條原始序列，比較分析得到145 262個OTU，樣品文庫的覆蓋率均大于等于0.89（表3），本次測序數(shù)據(jù)準確性及真實性較高，可客觀反映土壤中微生物的種群結構及差異性特征。結合OTU和群落豐富度指數(shù)chaol、ace可見，在煙草的3個生長期，煙田施加有機肥可不同程度的改變煙田土壤細菌的物種多樣性和群落豐富度：在平預期，以施用復合有機肥OFJ處理的OTU和群落豐富度指數(shù)chaol、ace最高，相較于單施化肥分別提高了14.80%、19.71%、18.17%：在采烤前期，以復合有機肥OFN影響最為明顯，相較于單施化肥OTU和群落豐富度指數(shù)chaol、ace分別提高了37.26%、35.26%、38.16%：在采烤后期，施用煙草秸稈有機肥的TS處理土壤細菌的群落豐富度指數(shù)chaol、ace最高，但OTU略低，而復合有機肥OFJ處理土壤細菌OTU最高?？梢?，土壤中施用有機肥較單施化肥提高了土壤細菌多樣性和豐富度，不同有機肥和不同煙草生長期，這種效應表現(xiàn)有差異。

2.2有機肥對優(yōu)勢菌群結構組成的影響

測序發(fā)現(xiàn)，供試3個有機肥和單施化肥的處理，其土壤細菌豐度前10個門均為：酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（chloroflexi）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、擬桿菌門（Baeteroidetes）、TM7、WS3（圖1）。在平預期，3種有機肥處理土壤中豐度位于前10的土壤細菌門中有8個門細菌豐度均較單施化肥處理提高，硝化螺旋菌門豐度均下降，細菌放線菌門豐度OFN、OFJ處理分別較單施化肥處理提高了34.48%、3.27%，但煙草秸稈有機肥TS處理則降低了9.69%。采烤前期，相較于單施化肥，OFN處理中位于前10位的細菌門豐度均提高，其中以TM7、WS3的豐度提升很大，分別為229.41%、244.00%，OFJ處理硝化螺旋菌門較單施化肥下降39.86%，TS處理酸桿菌門和硝化螺旋菌門分別降低了1.05%、51.35%。在采烤后期，3種有機肥處理的土壤細菌在門水平上豐度下降，其中OFN處理的酸桿菌門、放線菌門、變形菌門、綠彎菌門、厚壁菌門、硝化螺旋菌門豐度下降，OFJ處理的酸桿菌門、放線菌門、硝化螺旋菌門豐度下降，TS處理的酸桿菌門、硝化螺旋菌門豐度下降?？梢娫陂T分類水平上，施用有機肥能夠引起土壤細菌優(yōu)勢菌群結構的明顯變化。

經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)，土壤樣品中細菌豐度比例最高的前10個屬為：Kaistobacter.鏈霉菌屬、紅游動菌屬、芽孢桿菌屬、乳球菌屬、假絲酵母菌屬紅色桿菌屬、硝化螺旋菌屬、韓國生工菌屬、及Steroidobacter（圖2）。在平預期，OFN處理土壤細菌豐度位于前10個屬中8個屬豐度較對照提高，其中假絲酵母菌屬提高最大，相較于單施化肥提高848.13%，紅色桿菌屬、硝化螺旋菌屬豐度下降；OFJ和TS處理土壤細菌豐度位于前10個屬中的7個屬豐度較對照提高，其中假絲酵母菌屬提高最大，分別提升了1505.73%和669.71%，該兩種有機肥除同樣使紅色桿菌屬、硝化螺旋菌屬豐度下降外，還使Steroidobacter豐度下降。在采烤前期，OFN處理的土壤細菌豐度位于10的屬細菌豐度均較對照提高，OFJ和TS處理細菌的細菌豐度變化趨勢同平頂期一致，同樣，3種有機肥處理對假絲酵母菌屬豐度提升最大。在采烤后期，TS處理的土壤細菌豐度變化特征與前兩個時期一致，OFJ處理中的紅色桿菌屬、硝化螺旋菌屬豐度較對照提高，OFN處理的Kaistobacter.紅游動菌屬、假絲酵母菌屬豐度提高，其他豐度下降。

2.3不同施肥處理間PCA差異顯著性分析

對12個土壤樣品中OTU組成進行PCA分析，結果見圖3?？梢钥闯觯?種有機肥處理與單施化肥處理距離較遠，表現(xiàn)出有機肥處理與單施化肥處理在OTU組成上的較大差異，而有機肥處理間差異較小：煙草秸稈有機肥TS與復合有機肥OFJ處理的土壤細菌OTU組成差異較小，與復合有機肥OFN處理差異較大。圖中也顯示，TS、OFJ、單施化肥處理的土壤細菌OTU組成在3個煙草生育期之間差異較小，但OFN處理的則較大?？傮w表明，煙田施用有機肥，顯著改變了土壤細菌OTU組成特征。

2.4 KEGG代謝途徑第二層分類差異分析

基于KEGG代謝途徑第二等級對有機肥施用后土壤細菌群落功能的差異進行預測，由圖4可見，不同分組的樣品之間在微生物群落功能基因在代謝途徑上存在差異，不同路徑基因所占比例的大小不同。相較于單施化肥，煙田施用有機肥OFN后，土壤細菌在基于KEGG代謝途徑有5個途徑存在顯著差異，其中Translation和Immune System Diseases途徑基因數(shù)量顯著提高，而Transcription relatedproteins和Electron transfer carriers途徑基因數(shù)量降低。而有機肥施用OFJ則引起Transport andCatabolism.Metabolism of Cofaetors and Vitamins、Endocrine System.Function unknown等代謝途徑基因數(shù)量顯著提高，其中Nucleotide metabolism、Transcription related proteins、Metabolism ofCofactors and Vitamins途徑的基因數(shù)量顯著降低。煙草秸稈有機肥TS施入后，引起Translation途徑基因數(shù)量量顯著增加，Metabolism of Cofactors andVitamins途徑的基因數(shù)量顯著降低?？梢?，有機肥處理使煙田土壤細菌群落功能和代謝產(chǎn)生改變，不同有機肥對土壤細菌代謝路徑和代謝路徑中基因數(shù)量的改變效應表現(xiàn)不同。

3討論

土壤細菌多態(tài)性是土壤質量的綜合體現(xiàn)，本研究揭示出不同有機肥均可明顯提高土壤細菌的數(shù)量和多樣性，這跟毛君杰等、徐永剛等發(fā)現(xiàn)施用有機肥提高煙田以及其他作物土壤細菌的表現(xiàn)一致。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，有機肥對土壤細菌的作用效果跟煙草生育期有一定關系，復合有機肥OFJ和OFN可明顯提高煙田土壤細菌在平頂期或采烤前期的OTU和chaol、ace指數(shù)，而煙草秸稈有機肥則在采烤后期明顯提高土壤細菌chaol、ace指數(shù)。研究表明，有機肥施用可影響土壤細菌的優(yōu)勢菌屬，調整土壤微生物的群落結構。袁銘章等研究揭示秸稈有機肥增強了土壤酶活性，有利于土壤細菌群落的多樣性和穩(wěn)定性的提高：張云偉等發(fā)現(xiàn)有機肥顯著提高了烤煙根際的細菌數(shù)量和微生物總量，以及烤煙根際放線菌的數(shù)量。本研究結果顯示，OFN、OFJ和TS3種供試有機肥處理較單施化肥對土壤細菌優(yōu)勢菌屬均產(chǎn)生較大影響：3種供試有機肥可提高多數(shù)細菌的豐度，但會降低紅色桿菌屬和硝化螺旋菌屬的豐度。本研究基于KEGG代謝途徑的預測差異分析，也揭示3種有機肥的施用影響了土壤細菌的功能菌群。

本試驗證明煙田施用有機肥能夠改善煙田土壤細菌的群落結構，對煙田土壤保育的理論和實踐具有一定的指導意義，但需要進一步深入探究土壤細菌響應有機肥的詳細機制，更加科學利用有機肥進行土壤保育。

4結論

煙田施用有機肥，可明顯改變煙田土壤細菌多態(tài)性，明顯優(yōu)于單一施用化肥。有機肥的種類對煙田土壤細菌的數(shù)量及物種豐富度、在屬水平上的優(yōu)勢菌的影響不同，顯示出有機肥種類在土壤改良效應上的不同。在煙草的不同生育期，有機肥對土壤細菌多態(tài)性的影響表現(xiàn)有差異，不同有機肥的作用效果呈現(xiàn)不一樣的規(guī)律，顯示出土壤細菌響應有機肥的作用機制差異，和“土壤一土壤細菌一煙草”體系對有機肥存在整體動態(tài)響應?？傊?，有機肥能夠改變土壤細菌多態(tài)性，對維持煙田土壤生態(tài)系統(tǒng)平衡，實現(xiàn)煙田土壤保育有重要作用。