盧超 艾倫強 何銀生 劉海華 周武先 段媛媛 程天周 張美德

摘要 ISSR（inter simple sequence repeat）分子標記是基于PCR技術(shù)發(fā)展起來的一種多態(tài)性檢測技術(shù)，具有操作簡單、多態(tài)性和重復(fù)性好等優(yōu)點，近年來已廣泛用于植物遺傳多樣性、親緣關(guān)系等方面研究。該研究對ISSR-PCR實驗過程中常遇到的一些問題，如條帶拖尾、有無、扭曲等問題進行了分析總結(jié)，并提出了相應(yīng)的解決方法供參考。

關(guān)鍵詞 ISSR；常見問題；分析；解決方法

中圖分類號 Q37 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）27-0091-04

Troubleshooting Analysis in ISSR Experiment

LU Chao，AI Lunqiang，HE Yinsheng et al

（Institute of Chinese Herbal Medicine， Hubei Academy of Agricultural Science/Hubei Provincial Agricultural Science and Technology Innovation Center，Chinese Medicine Branch，Enshi，Hubei 445000）

Abstract ISSR （inter simple sequence repeat） marker is a PCRbased technique aiming to detect polymorphism in DNA， which features easytooperate， abundant polymorphism and robust reproducibility. To date， ISSR has been widely used in plant genetic diversity and phylogenetic relation study. In this paper， we summarized some problems frequently occured in ISSR experiment and gave relevant suggestions to solve these problems as reference.

Key words Inter simple sequence repeat （ISSR）；Frequently asked question（FAQ）；Analysis；Solution

基金項目 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年基金項目（2014NKYJJ11）；湖北省技術(shù)創(chuàng)新專項（鄂西民族專項）（2016AKB053）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS-21）。

作者簡介 盧超（1986—），男，湖北孝昌人，助理研究員，碩士，從事藥用植物遺傳育種與栽培研究。*通訊作者，副研究員，從事中草藥資源、栽培、藥用植物生理生態(tài)研究。

收稿日期 2018-05-25

ISSR（inter simple sequence repeat）分子標記是以植物中廣泛存在的微衛(wèi)星序列為基礎(chǔ)，開發(fā)出以簡單重復(fù)序列為單引物進行多位點PCR擴增的檢測技術(shù)。該標記的首要特點就是引物設(shè)計無需預(yù)知分析物種的基因組序列，能夠直接擴增2個序列相同但方向相反的反向重復(fù)序列之間的DNA片段。ISSR技術(shù)具有操作簡單，且同時綜合了其他分子標記多態(tài)性好、可重復(fù)性、低成本以及無需知道基因組序列等優(yōu)點。由于植物基因組中微衛(wèi)星廣泛分布，且等位變異特別豐富，采用ISSR擴增條帶多態(tài)性較豐富，因此被認為是一種理想的遺傳標記。

近年來，ISSR標記已經(jīng)被廣泛用于品種鑒定和種質(zhì)資源收集[1-4]、遺傳作圖、基因定位及標記輔助選擇[5-7]、遺傳多樣性和系統(tǒng)進化關(guān)系[8-9]以及短重復(fù)基序豐度預(yù)測及輔助設(shè)計SSR引物[10-12]。但是，在ISSR標記技術(shù)的應(yīng)用過程中，從樣品采集、DNA提取、引物篩選與PCR擴增到凝膠電泳檢測均存在一些操作誤區(qū)和局限性，從而對擴增結(jié)果及最終的數(shù)據(jù)分析產(chǎn)生不利影響。迄今為止，針對ISSR擴增結(jié)果不理想的研究大多集中于ISSR-PCR反應(yīng)體系構(gòu)建與優(yōu)化，鮮有涉及ISSR整個過程存在問題的分析報道。筆者結(jié)合多年ISSR操作中遇到的各種問題進行分析，為其他實驗人員進行ISSR研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料為川續(xù)斷，采于湖北恩施市三岔鄉(xiāng)、新塘鎮(zhèn)、中營鎮(zhèn)，宜昌市五峰縣等地。選取新鮮幼嫩葉片純水洗凈后裝袋，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

核酸染料購自天恩澤；Taq Master Mix購于北京康為世紀生物科技有限公司；PCR儀由BioRAD公司生產(chǎn)；電泳儀以及凝膠成像系統(tǒng)均購自北京六一生物科技有限公司；SIGMA離心機；島津紫外可見光分光光度計。該試驗100條ISSR 引物是參照加拿大哥倫比亞大學(xué)（UBC）所設(shè)計的引物序列，并交由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，試驗用引物見表1。

1.2 DNA提取

以中草藥川續(xù)斷的新鮮葉片為材料，采用北京康為世紀生物科技有限公司植物基因組DNA提取試劑盒進行川續(xù)斷基因組DNA的提取。用1%的瓊脂糖初步檢測提取DNA的完整性及濃度。紫外分光光度計測定DNA的OD值以及濃度。將提取的DNA經(jīng)稀釋后分裝至-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 ISSR-PCR反應(yīng)及電泳產(chǎn)物檢測

采用實驗室前期優(yōu)化的ISSR-PCR反應(yīng)體系：每18 μL的反應(yīng)體系中含有2×Taq Master Mix 10.44 μL，模板DNA 45 ng。擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s（進行40個循環(huán)）；72 ℃繼續(xù)延伸10 min；4 ℃保存。用含有DNA green核酸染料的1%瓊脂糖凝膠對PCR擴增產(chǎn)物進行分離，于凝膠成像系統(tǒng)進行拍照保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 無條帶或者條帶微弱

擴增結(jié)果如圖1所示，所用引物均為UBC813。圖1a中，除第一泳道的Marker以外，其他點樣的幾個泳道均無任何可見的擴增條帶產(chǎn)生，且部分泳道點樣孔亮度很高。圖1b中，除兩側(cè)的Marker可見外，擴增條帶非常微弱，出現(xiàn)上述情況，可能有三方面原因：①ISSR引物選擇不恰當，使得在模板DNA上沒有合適的互補序列，導(dǎo)致引物無法和模板DNA有效結(jié)合，擴增后沒有產(chǎn)物或僅僅少量的非特異性擴增產(chǎn)物。②引物擴增的片段過大，超過了瓊脂糖凝膠的分辨率，使得擴增產(chǎn)物無法在凝膠中有效遷移，進而使PCR產(chǎn)物堆積在點樣孔無法向正極移動，出現(xiàn)點樣孔很亮而相應(yīng)泳道沒有可見的擴增條帶的現(xiàn)象。③提取的DNA純度不高，含有未除凈的蛋白或抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)，或者提取的DNA保存不當，出現(xiàn)了降解。

針對上述情況，日常的ISSR實驗中，在體系優(yōu)化的基礎(chǔ)上，做好以下幾方面工作：①針對次生代謝物含量比較豐富的植物物種，尤其是富含酚類物質(zhì)的物種，應(yīng)該摸索適宜的基因組DNA提取方法或者采用專門的植物基因組DNA提取試劑盒，盡量消除酚類物質(zhì)、蛋白、殘留的乙醇等雜質(zhì)，以免干擾下游PCR。②由于ISSR為隨機引物，需針對特定的物種進行引物預(yù)篩選，選擇合適的引物，以能夠擴增出清晰、穩(wěn)定、重復(fù)性好的條帶為標準。此外，鑒于ISSR引物的隨機性以及引物篩選工作量大的問題，可以查閱相關(guān)文獻，查找與之親緣關(guān)系相近的物種進行ISSR分析時采用的引物序列，可以極大地減輕工作量。

2.2 條帶拖尾

擴增結(jié)果如圖2a所示，擴增引物為UBC818，膠圖出現(xiàn)非常嚴重的拖尾現(xiàn)象。造成這種現(xiàn)象的原因主要是：①引物退火溫度偏低，一方面ISSR反應(yīng)擴增區(qū)域為分布于植物基因組內(nèi)重復(fù)序列之間的片段，重復(fù)序列通常間隔較遠，導(dǎo)致常規(guī)的PCR反應(yīng)不能夠擴增出這些特異片段，較低退火溫度下ISSR部分引物會和這部分重復(fù)序列結(jié)合，產(chǎn)生長度不一的彌散拖尾條帶；另一方面，偏低的退火溫度使得引物與重復(fù)序列結(jié)合位點出現(xiàn)滑動，導(dǎo)致電泳條帶模糊不清。②引物濃度偏高，引物內(nèi)部形成引物二聚體。③PCR循環(huán)次數(shù)過多，導(dǎo)致錯配。

隨后采用同一模板DNA和相同的反應(yīng)體系，更換引物為UBC824和UBC844，分別進行PCR擴增，擴增結(jié)果見圖2b。從圖中可以看出，相同的反應(yīng)體系下，引物UBC824擴增結(jié)果呈現(xiàn)為拖尾涂抹，幾乎沒有可見的主帶產(chǎn)生，而UBC844擴增結(jié)果條帶清晰可見，無拖尾現(xiàn)象出現(xiàn)。由于ISSR引物本身是隨機引物，與模板DNA的結(jié)合區(qū)有很大的不確定性，因此，在ISSR擴增結(jié)果產(chǎn)生拖尾彌散時，也有可能是所用的引物不適用于該物種的擴增反應(yīng)，可以考慮更換其他的引物序列進行ISSR擴增分析。

2.3 條帶彎曲

從圖3a可以看出，圖中左右兩側(cè)的Marker和中間的擴增條帶均出現(xiàn)不同程度的扭曲變形，造成這種現(xiàn)象的原因主要是上樣量過大。為驗證這一推論，進行一系列上樣量梯度試驗，從圖3b可以看出，膠圖左邊的5個泳道條帶比較整齊平直，上樣量為2 μL，而靠近Marker右邊的5個泳道條帶呈現(xiàn)出扭曲月牙形，上樣量為6 μL。造成圖中條帶扭曲的主要原因是上樣量過大，上樣量過多會造成加樣孔超載，從而導(dǎo)致條帶扭曲。

2.4 條帶傾斜

所用擴增引物為UBC809，PCR擴增模板為川續(xù)斷DNA模板，從圖4可以看出，擴增條帶明顯傾斜，同一分子量的主帶不在一條水平線上。造成這種現(xiàn)象的主要原因是電泳過程中，電泳槽沒有水平放置，電泳液在膠面上分布不均勻，導(dǎo)致條帶在凝膠中所受電場力不一，造成條帶傾斜嚴重。解決的方法是在電泳前，將電泳槽放置在桌面水平的實驗臺上，同時調(diào)整電泳槽的4個支腳，使電泳槽液面水平。同時，電泳期間盡量不要晃動臺面，避免擾動液面造成電泳液分布不均。

2.5 條帶未跑開

所用擴增引物為UBC809，如圖5所示，ISSR擴增條帶均聚集到一起，互相重疊拖尾，主帶也出現(xiàn)了扭曲變形。出現(xiàn)此現(xiàn)象，主要原因：①上樣量過大，各個分子量的條帶不能有效分離；②電泳條件設(shè)置不合理，電泳時電壓設(shè)置過高導(dǎo)致發(fā)熱，或者電泳時間不夠。

優(yōu)化與解決方法：①ISSR擴增產(chǎn)物上樣前，應(yīng)根據(jù)點樣孔的大小適當調(diào)整PCR產(chǎn)物的上樣體積；②跑膠前，摸索電泳的條件，應(yīng)根據(jù)灌制凝膠的大小，適當延長電泳時間，調(diào)整電泳電壓，一般凝膠電泳時場強不超過20 V/cm，過高會導(dǎo)致凝膠過熱變形，影響分離效果。

3 討論

ISSR是基于植物基因組中大量存在的簡單重復(fù)序列發(fā)展起來的一種標記技術(shù)，廣泛應(yīng)用于植物的遺傳多樣性分析與種質(zhì)資源的鑒定研究[13]。目前，查閱大量文獻發(fā)現(xiàn)大量研究均集中在對ISSR-PCR反應(yīng)體系本身的優(yōu)化，通過設(shè)計正交或者均勻設(shè)計試驗來優(yōu)化PCR反應(yīng)各組分的用量，進而改善ISSR擴增條帶的清晰度和穩(wěn)定性。然而，針對在整個ISSR實驗過程中常存在的一些棘手問題，比如條帶扭曲、涂抹帶以及條帶暗弱的現(xiàn)象，目前還鮮有文獻報道以及系統(tǒng)研究。出現(xiàn)這些問題的很大一部分原因不只是由于反應(yīng)體系沒有優(yōu)化，還有后期實驗操作和參數(shù)設(shè)置不合理，如瓊脂糖電泳電壓設(shè)置及電泳時間等。該研究針對ISSR實驗中常見的5個問題分別進行了分析討論，并提出了相應(yīng)的解決方法。

在ISSR實驗中，經(jīng)常出現(xiàn)擴增后的產(chǎn)物電泳后無可見條帶或者僅有隱約可見的弱帶。由于ISSR標記技術(shù)無需預(yù)知擴增序列信息，與基因組DNA結(jié)合的位點具有很大隨機性，造成這種現(xiàn)象的原因可能比較復(fù)雜。常規(guī)的PCR反應(yīng)實驗中，引物序列都是基于已知目標序列設(shè)計出來的，擴增有很強的針對性，因此，出現(xiàn)無擴增條帶，一般主要是由于引物設(shè)計不合理和退火溫度不合適造成的[14]。ISSR擴增結(jié)果出現(xiàn)無條帶時，可能是所選引物本身就和模板DNA沒有合適的結(jié)合位點。因此，ISSR實驗前期需要做大量預(yù)實驗進行引物的篩選工作，篩選出能夠擴增出條帶的ISSR引物，然后進行PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化。

ISSR實驗中常常會出現(xiàn)條帶拖尾現(xiàn)象，一般研究認為，條帶拖尾主要是由于PCR反應(yīng)條件不合適，引物退火溫度過低，造成大量的非特異性擴增[15]。該實驗對這個問題進行了分析，認為在ISSR實驗中，拖尾的原因除了常規(guī)PCR中退火溫度過低以外，引物序列本身可能也是一個原因。ISSR引物序列通常在末端有幾個錨定堿基，但是有些錨定堿基可能在模板DNA中不能起到錨定的作用，導(dǎo)致在目標序列附

近滑動，產(chǎn)生一系列大小不一的擴增片段，形成拖尾涂抹狀條帶。

此外，ISSR反應(yīng)中，常常伴隨產(chǎn)生條帶扭曲和未跑開。該研究對這兩個現(xiàn)象進行了分析，認為主要是由于點樣時，上樣量過大和電泳時電壓和時間設(shè)置不合適造成的。上樣量過大，超過了點樣孔的負荷，條帶不能有效得到分離。電泳時電壓過大，容易造成電泳緩沖液和瓊脂糖凝膠發(fā)熱，也會造成條帶扭曲變形。此外，電泳時間也需適當延長，電泳時間過短條帶仍聚集在一起，沒有得到有效分離，也會呈現(xiàn)出聚成一團的扭曲狀?？傊?，ISSR電泳條件需要摸索，根據(jù)實驗室電泳儀的特點進行調(diào)優(yōu)，電壓降低的同時適當延長電泳時間，以指示劑溴酚藍跑到凝膠2/3處為宜，過長的電泳時間會造成核酸染料漂移，造成小片段的條帶暗弱。

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