大豆疫霉菌PsSed5編碼基因轉(zhuǎn)錄分析及功能研究

趙偉　遲元凱　汪濤

摘要[目的]研究大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）SNARE家族之一的編碼基因PsSed5轉(zhuǎn)錄及功能。[方法]利用實(shí)時(shí)定量PCR分析PsSed5在大豆疫霉不同生活史及侵染時(shí)間段的轉(zhuǎn)錄，利用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化法，將該基因沉默后分析沉默轉(zhuǎn)化子的表型。[結(jié)果]PsSed5是組成性表達(dá)，在侵染早期表達(dá)量較高，PsSed5的2個(gè)沉默轉(zhuǎn)化子菌絲生長減慢，致病力減弱。[結(jié)論] PsSed5在大豆疫霉的生長發(fā)育及致病性方面都發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞大豆疫霉；SNARE；PsSed5；基因沉默

中圖分類號S188文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A文章編號0517-6611（2018）08-0105-03

Transcriptional Analysis and Functional Study of PsSed5 Gene of Phytopnthora sojae

ZHAO Wei，CHI Yuankai，WANG Tao et al（Institute of Plant Protection and Product Quality and Safety，Anhui Academy of Agricultural Sciences，Hefei，Anhui 230031）

Abstract[Objective] To analyze the transcription and the gene function of PsSed5，one of the SNARE proteins in Phytophthora sojae. [Method]Using the realtime PCR analyzed the PsSed5 expression in different developmental and infection stages.Using the PEGmediated DNA transformation obtained the PsSed5 silencing transformants to research its phenotype.[Result] The PsSed5 is constitutively expressed during various life stages and the course of infection，with the relatively highest expression levels in early infection，while the hypha from the silencing transformants growth slowly with weak pathogenicity.[Conclusion] The results show that PsSed5 is important for growth and contributes to the full virulence of P.sojae.

Key wordsPhytophthora sojae；SNARE；PsSed5；Gene silencing

基金項(xiàng)目安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（1508085MC43）。

作者簡介趙偉（1980—），男，安徽壽縣人，副研究員，博士，從事植物病理學(xué)研究。* 通訊作者，研究員，博士，從事真菌病害及綜合治理技術(shù)研究。

收稿日期2018-01-22

大豆疫病是由大豆疫霉（Phytophthora sojae）引致的大豆毀滅性病害之一，在大豆不同生育時(shí)期均能發(fā)病，給大豆產(chǎn)業(yè)帶來嚴(yán)重威脅。植物病原菌若要成功侵染寄主，必須破壞寄主植物的系列防衛(wèi)反應(yīng)系統(tǒng)，而寄主植物在感知病原菌侵染后，會產(chǎn)生主動的防衛(wèi)反應(yīng)，以達(dá)到破壞寄主侵入的目的。在這種漫長的相互斗爭、克制與反克制過程中，病原菌進(jìn)化出了復(fù)雜的侵染機(jī)制。病原菌通常使用某種毒性策略，如通過分泌一系列的外泌蛋白來改變寄主細(xì)胞的代謝途徑，從而達(dá)到成功侵染的目的[1-2]。在真核生物中外泌蛋白的分泌需要膜泡運(yùn)輸參與調(diào)控，而SNARE（soluble Nethylmaleimidesensitive factor attachment protein receptors）蛋白是真核生物細(xì)胞膜泡運(yùn)輸過程中發(fā)生膜融合最重要的調(diào)控蛋白家族，在真核生物中較為保守。SNARE作為調(diào)控細(xì)胞生長發(fā)育必不可少的蛋白家族，在人類、酵母及植物病原真菌中得到了大量的研究。Sed5是SNARE蛋白家族成員之一，為QaSNARE亞基，是高爾基器膜泡轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的中心組分。在順向運(yùn)輸過程中，Sed5與Sec22、Bos1、Bet1形成SNARE四聚復(fù)合體介導(dǎo)膜泡融合[3-4]。

筆者利用實(shí)時(shí)定量PCR分析PsSed5在大豆疫霉不同生活史及侵染時(shí)間段的轉(zhuǎn)錄，并利用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的方法將該基因沉默后分析沉默轉(zhuǎn)化子的表型，明確其功能，以期為揭示SNARE蛋白對大豆疫霉生長發(fā)育及對大豆致病過程的分子機(jī)理提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株。大豆疫霉菌株P(guān)6497，由美國俄勒岡州立大學(xué)Brett M.Tyler教授饋贈，系大豆疫霉全基因組測序菌株，保存在10 ℃條件下的10%V8固體培養(yǎng)基上。

1.1.2大豆品種。大豆品種Williams，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家大豆改良中心提供，該品種對大豆疫霉菌株P(guān)6497表現(xiàn)為感病。

1.2方法

大豆疫霉轉(zhuǎn)化方法如下[5-6]：收集菌絲，將菌絲放入含有0.8 mol/L甘露醇的培養(yǎng)皿中漂洗，將漂洗過后的菌絲移入盛有0.8 mol/L甘露醇的離心管中室溫?fù)u洗10 min；用滅過菌的50 mL燒杯快速稱取0.1 g 溶解酶和0.06 g 纖維素，蓋緊杯口迅速拿回超凈臺。依次加入10 mL 0.8 mol/L甘露醇、8 mL H2O、800 μL 0.5 mol/L KCl、800 μL 0.5 mol/L MES （pH 5.7）和400 μL 0.5 mol/L CaCl2，充分溶解酶液后將其倒入50 mL離心管，并加入已洗好的菌絲，25 ℃ 40 r/min 酶解45～60 min；用20 mL針筒和細(xì)菌過濾器過濾40%PEG，將盛有PEG的燒杯封口后放于冰上備用；用2層Mira Cloth和燒杯過濾收集原生質(zhì)體，收集好后倒入新的離心管中，1 500 r/min、3 min后輕輕倒去上清液；用35 mL W5 溶液洗滌原生質(zhì)體，1 500 r/min、4 min后輕輕倒去上清液；用5 mL W5溶液重懸原生質(zhì)體至濃度為2×106個(gè)/mL，冰置30 min后，1 500 r/min、4 min，輕輕倒去上清液；用5 mL MMg 溶液重懸原生質(zhì)體，室溫放置10 min；在每個(gè)含有質(zhì)粒的離心管中加入1 mL原生質(zhì)體，冰置5～10 min；每個(gè)離心管加1.74 mL PEG，冰置2 min；往離心管中加8 mL Pea/0.5 mol/L甘露醇緩慢顛倒1次；次日上午加熱溶化Pea/0.5 mol/L甘露醇瓊脂，降溫至40 ℃以下后加入G418至濃度為30 μg/mL，混勻后倒入培養(yǎng)皿中25 ℃黑暗培養(yǎng)；待新生菌絲長出后，用含30 μg/mL G418的Pea/0.5 mol/L甘露醇覆蓋平板，25 ℃黑暗培養(yǎng)；待菌絲從覆蓋的Pea/0.5 mol/L甘露醇上長出后，用含50 μg/mL G418的Pea/0.5 mol/L甘露醇或利馬豆培養(yǎng)基再次覆蓋平板，25 ℃黑暗培養(yǎng)；挑取最終從平板上長出的菌落，于50 μg/mL G418利馬豆培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)。

用OMEGA Total RNA Kit I提取大豆疫霉菌不同生長階段及侵染階段的總RNA。提取的候選轉(zhuǎn)化子的總RNA經(jīng)DNAase消解后按照invitrogen M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用指南合成單鏈cDNA，-20 ℃冰箱保存供實(shí)時(shí)定量PCR（Realtime quantitative PCR，qRT-PCR）使用。所用實(shí)時(shí)定量引物分別為qRTF1：5′-GGAGTTAGTGCCAGCGAGTC-3′ 和qRTR1：5′-AAGAGCTGTCCGATGTCCAC-3′，所用的內(nèi)參基因?yàn)榧拥鞍拙幋a基因，引物為PsactA-F：5′-ACTGCACCTTCCAGACCATC-3′ 和 PsactA-R：5′-CCACCACCTTGATCTTCATG-3′，定量分析及沉默轉(zhuǎn)化子的篩選。用于驗(yàn)證外源轉(zhuǎn)化子是否插入基因組的引物為載體上游引物HAMF1：5′-TTCTCCTTTTCACTCTCACG-3′和PsSed5基因的上游引物PsSed5F：5′- ATGGCGGCGAACCGCACGG-3′。

2結(jié)果與分析

2.1大豆疫霉菌PsSed5基因的克隆及序列結(jié)構(gòu)分析

大豆疫霉中PsSed5基因（ID：303106，https：//genome.jgi.doe.gov/Physo3

/Physo3.home.html）DNA和CDS全長序列分別從DNA和cDNA中被擴(kuò)增出來，分別為1 214、996 bp，其中有3個(gè)內(nèi)含子，蛋白序列由331個(gè)氨基酸組成。通過氨基酸生物信息學(xué)分析及結(jié)構(gòu)預(yù)測，PsSed5氨基酸的234～301位氨基酸為SNARE核心保守功能區(qū)域，該區(qū)域與其他SNARE蛋白形成復(fù)合體，促進(jìn)不同細(xì)胞膜間的融合；321～329位氨基酸為跨膜區(qū)域，將SNARE蛋白結(jié)合在細(xì)胞膜上。

2.2PsSed5在生活史階段及侵染階段的轉(zhuǎn)錄分析

為了更進(jìn)一步了解及預(yù)測這些PsSed5編碼基因可能具有的功能，對該基因在無性生活史及侵染階段的轉(zhuǎn)錄譜進(jìn)行了詳細(xì)分析，所選階段分別是V8液培的菌絲、產(chǎn)孢子囊的菌絲、游動孢子、休止孢、萌發(fā)的休止孢、侵染感病大豆品種1.5、3、6、12和24 h的菌絲。通過實(shí)時(shí)定量PCR分析可以發(fā)現(xiàn)，PsSed5在不同階段均有較高的表達(dá)量，屬于組成性表達(dá)基因，在侵染早期上調(diào)表達(dá)，說明其對疫霉菌的侵染或許有一定的調(diào)控作用（圖1）。

2.3PsSed5沉默突變體的獲得

為了進(jìn)一步研究PsSed5在大豆疫霉生長發(fā)育及致病過程等方面的具體功能，利用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的方法將該基因沉默后進(jìn)行基因功能分析。將PsSed5反向基因片段構(gòu)建到pHAM34的啟動子后，同時(shí)將其與含有抗遺傳霉素（G418）的pTH209載體共轉(zhuǎn)化到大豆疫霉的原生質(zhì)體中。將PsSed5反向基因片段構(gòu)建到載體上，選用pHAM34啟動子的一段引物作為上游引物，PsSed5基因中靠近5′端的序列作為下游引物，這樣就可以擴(kuò)增出轉(zhuǎn)化子插入片段。在試驗(yàn)中，將只單獨(dú)轉(zhuǎn)進(jìn)含有抗性載體pTH209而獲得的轉(zhuǎn)化子作為對照（CK）。通過試驗(yàn)可以看到T12、T17和T20都能擴(kuò)增出目的片段，而野生型菌株和對照菌株沒有擴(kuò)增出目的片段（圖2）。進(jìn)一步提取上述轉(zhuǎn)化子菌絲階段的RNA，利用實(shí)時(shí)定量PCR方法篩選沉默的轉(zhuǎn)化子。相比較野生型的受體菌株（WT），對照菌株（CK）的表達(dá)量沒有顯著差異，T12和T17的表達(dá)量顯著降低，分別為野生型的41%和45%，而另一個(gè)轉(zhuǎn)化子T20的表達(dá)量與野生型菌株沒有差異。因此得到T12和T17 這2個(gè)部分沉默的突變體（圖3）。

2.4PsSed5沉默突變體表型分析及致病力測定

進(jìn)一步分析T12和T17 這2個(gè)部分沉默的突變體在疫霉生活史的各個(gè)階段表型上的變化。將在含遺傳霉素培養(yǎng)基生長的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接活化2代后在V8培養(yǎng)基上觀察生長速率，3 d后測量菌落直徑，得到的平均值分別為WT：3.8 cm、CK：3.7 cm、T12：2.8 cm、T17：2.9 cm，由此可以發(fā)現(xiàn)PsSed5沉默突變體生長速率受到一定的影響。在LBA培養(yǎng)基上生長10 d后，觀測有性生殖產(chǎn)生卵孢子的情況，從菌落生長中心接種點(diǎn)附近隨機(jī)挑取2 cm×2 cm的瓊脂塊，記錄卵孢子個(gè)數(shù)，隨機(jī)取3個(gè)點(diǎn)，平均值分別為WT：258、CK：267、T12：45、T17：33，這說明PsSed5沉默突變體在有性生殖過程中受到嚴(yán)重影響。為了進(jìn)一步證實(shí)沉默轉(zhuǎn)化子的穩(wěn)定性，將PsSed5沉默突變體的轉(zhuǎn)化子在不含遺傳霉素的V8培養(yǎng)基上連續(xù)繼代培養(yǎng)10代后，重復(fù)上述試驗(yàn)，結(jié)果同上面的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)趨勢相一致。

進(jìn)一步分析PsSed5沉默突變體在致病性方面的變化。用野生型菌株和PsSed5沉默突變體菌株接種生長10 d的Williams大豆。大豆疫霉在含1%瓊脂的V8培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d，在菌落邊緣切取2 mm×2 mm的菌絲塊作為接種體接種沒有創(chuàng)傷的葉片，2 d后發(fā)現(xiàn)野生型菌株在大豆葉片上形成明顯的擴(kuò)展，發(fā)病顯著，而PsSed5沉默突變體菌株幾乎沒有擴(kuò)展，說明其喪失了致病性（圖4）。同樣將繼代培養(yǎng)10代的突變體菌株進(jìn)行上述致病性測定，得到同上述試驗(yàn)相同的結(jié)果。

3結(jié)論與討論

細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間的物質(zhì)交換需要膜泡參與運(yùn)輸，而SNARE蛋白是膜泡間融合的必要因子，SNARE蛋白家族之一的Sed5參與多種運(yùn)輸膜泡之間的融合，其在酵母中是細(xì)胞存活所必需的因子之一[4]。在大豆疫霉中，PsSed5基因是組成性高表達(dá)，說明其參與了大豆疫霉生長發(fā)育及侵染的各個(gè)過程，而其沉默突變體表型的變化也證明了該基因在大豆

疫霉菌中起到重要作用。PsSed5沉默突變體的致病性幾乎喪失，但考慮到其生長速率有所減慢，菌絲生長勢弱，因此不能排除其致病性下降是生長速率減弱所引起的。但近期的研究報(bào)道中，真菌一系列和外泌相關(guān)基因的功能解析表明，這些基因的缺失會導(dǎo)致一系列致病因子的外泌受到破壞，從而導(dǎo)致致病性的喪失[7]。疫霉屬植物病原菌中包含大量的RxLR類外泌效應(yīng)因子，其中很多被證明在侵染過程中發(fā)揮著重要的作用[8] ，因此推測，PsSed5沉默突變體致病性的喪失可能是由于致病因子在外泌過程中被阻斷，從而導(dǎo)致大豆疫霉不能成功侵染寄主。在后續(xù)研究中，擬通過分析野生型菌株和PsSed5沉默突變體菌株在外泌蛋白的分泌上是否有質(zhì)和量的差異，以揭示其致病力減弱的主要原因，并找出大豆疫霉菌關(guān)鍵性的致病因子，為大豆疫霉菌的防控提供理論依據(jù)。

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