化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法檢測蝦肉中磺胺類藥物的殘留

汪善良　程茹　鐘新敏

摘要[目的]通過對比化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法（CMIA）和高效液相色譜-質(zhì)譜法對蝦肉中磺胺類藥物檢測結(jié)果的差異，驗(yàn)證公司自研的磺胺類藥物化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒的檢測效果。[方法]以蝦肉為檢測原料，采用直接競爭CMIA法對試劑盒進(jìn)行靈敏度、特異性、精密度、準(zhǔn)確度試驗(yàn)。[結(jié)果]試劑盒檢測靈敏度為1.04 μg/kg、加樣回收率為95.25%～104.50%，變異系數(shù)（CV）均小于15%；試劑盒檢測結(jié)果與儀器分析的陰、陽性結(jié)果接近。[結(jié)論]該方法檢測結(jié)果穩(wěn)定、可靠，達(dá)到國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，表明該款試劑盒可滿足動(dòng)物組織中磺胺類藥物的快速檢測需求。

關(guān)鍵詞蝦肉；化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法；高效液相色譜-質(zhì)譜法；磺胺類藥物

中圖分類號S859.84文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2018）08-0170-04

Detection of Sulfonamides Residues in Shrimp by Chemiluminescence Microparticle Immuno Assay（CMIA）

WANG Shanliang， CHENG Ru，ZHONG Xinmin et al

（Guizhou Kwinbon Food Safety ScienceTechnology Co.， Ltd.， Guiyang Guizhou 550009）

Abstract[Objective]To verify the test effect of the companys production of sulfonamides chemiluminescence microparticle immuno assay（CMIA）detection kit， the method of chemiluminescent microparticle immuno assay and high performance liquid chromatographymass spectrometry was used to detect the residues of sulfonamides in shrimp samples， and compared the difference between the two methods of test results. [Method]Shrimp meat as raw material for detection， the kits about sensitivity， specificity， precision and accuracy were tested by direct competitive CMIA method. [Result]The sensitivity of the kit was 1.04 μg/kg， the average recovery was 95.25%-104.50%， the coefficient of variation CV all were less than 15%； The results for shrimp by CMIA method were well consistent with as the results of HPLCMS method.[Conclusion]The results for shrimp by CMIA method are stable and reliable， and meet the relevant national standards. It shows that this kit can meet the requirements of rapid detection of sulfonamides in animal tissues.

Key wordsShrimp；Chemiluminescent microparticle immuno assay（CMIA）；High performance liquid chromaloagraphymass spectrometry（HPLCMS）；Sulfonamides

基金項(xiàng)目2017年貴州省工業(yè)和信息化發(fā)展專項(xiàng)資金計(jì)劃項(xiàng)目（2017002）；2016年貴陽市經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目；2016年貴州省技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目；2016年貴州省科技廳社會(huì)攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合〔2016〕支撐2908號）；2017年貴州省科技支撐項(xiàng)目（黔科合支撐〔2017〕2034）；貴陽市2016年人才創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)資助項(xiàng)目（筑人才辦合同字〔2016〕第13號）。

作者簡介汪善良（1979—），男，貴州貴陽人，高級工程師，從事食品安全快速檢測技術(shù)的研究與開發(fā)工作。*通訊作者，碩士，從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測技術(shù)應(yīng)用研究。

收稿日期2017-11-16；修回日期2017-12-05

含有特征結(jié)構(gòu)為對氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類物質(zhì)可統(tǒng)稱為磺胺類藥物，該藥物是獸醫(yī)臨床上常用的藥物，被廣泛用于預(yù)防和治療細(xì)菌感染性疾病和原蟲病等[1]，但也存在嚴(yán)重的副作用，不合理使用很容易在動(dòng)物組織中造成殘留，從而對人類的健康產(chǎn)生潛在的危險(xiǎn)[2]。農(nóng)業(yè)部第235號文件規(guī)定，磺胺類藥物殘留量總量限量為100 μg/kg[3]，人體若長期累積過量會(huì)產(chǎn)生排尿及造血紊亂、過敏等危害[4]，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)細(xì)菌對其產(chǎn)生抗藥性，并伴隨潛在的致癌性[5]。

磺胺類藥物目前常規(guī)的檢測方法是微生物學(xué)法，更為精準(zhǔn)的分析方法則是儀器分析和免疫法。微生物法因耗時(shí)、精度和靈敏度低而無法定量分析使其應(yīng)用受限；儀器分析方法雖然準(zhǔn)確、靈敏，但均存在前處理程序繁雜、操作專業(yè)性強(qiáng)等諸多弊端而使得此類方法應(yīng)用受限。免疫法主要包括酶聯(lián)免疫法和化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法（CMIA）等，該法因具有操作簡單、靈敏度高、成本低、可批量檢測等優(yōu)勢，可廣泛應(yīng)用[6-10]。

筆者采用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法對蝦肉中11種磺胺類藥物進(jìn)行測定，通過與儀器分析對比，以驗(yàn)證貴州勤邦食品安全科學(xué)技術(shù)有限公司研制的化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒檢測水平是否達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)，從而為蝦肉的快速檢測提供符合要求的檢測手段。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料與主要試劑。

蝦肉，購于當(dāng)?shù)爻?，取蝦身中間部位。

11種磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品，純度>99.6%，美國Sigma公司；甲酸（優(yōu)級純）、正己烷（色譜純）、乙腈（色譜純）、乙酸乙酯（分析純）、氫氧化鈉（分析純）、正丙醇（分析純）等，以上試劑均來自于貴州嘉潤試劑有限公司。

磺胺類藥物化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析測定試劑盒，由貴州勤邦食品安全科學(xué)技術(shù)有限公司自主研發(fā)。

1.1.2主要儀器與設(shè)備。

磁免疫全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光檢測儀，由貴州勤邦食品安全科學(xué)技術(shù)有限公司自主研發(fā)；液質(zhì)聯(lián)用儀（LC-MS）（TSQ Quantum Ultra），美國Thermo；QL-901渦旋儀，廈門市?？祪x器有限公司；FSH-Ⅱ 型高速電動(dòng)勻漿機(jī)，江蘇中大儀器廠；DSY-111氮吹儀，上海喬躍電子科技有限公司；HT-200 B恒溫振蕩器，金壇市城西春蘭實(shí)驗(yàn)儀器廠；TG16-WS高速離心機(jī)，常州市金壇高科儀器廠；微量移液管（單道20～200 μL，100～1 000 μL），美國Thermo 公司；CPA225D電子天平（0.01 mg），江蘇明德儀器電子科技有限公司。

1.2方法

1.2.1化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法檢測原理。

化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法采用直接競爭原理，首先在磁免疫全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光檢測儀反應(yīng)杯中依次加入預(yù)處理好的蝦肉樣品、已標(biāo)記了的磺胺類藥物半抗原、已包被單克隆抗體的磁性顆粒。在含有3種物質(zhì)的反應(yīng)杯中，蝦肉中所含有的磺胺類藥物與酶標(biāo)記抗原形成競爭關(guān)系，共同爭奪磁性顆粒上的磺胺類藥物抗體并與之結(jié)合?？乖贵w完成結(jié)合過程后，反應(yīng)杯則被置于磁性分離區(qū)域，使得反應(yīng)杯中與固相未結(jié)合的物質(zhì)被分離，之后將化學(xué)發(fā)光底物加入其中。

用光子計(jì)數(shù)儀測定反應(yīng)杯中各孔的光子計(jì)數(shù)值，這一數(shù)值的大小與磺胺類藥物濃度呈良好的負(fù)相關(guān)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)物質(zhì)實(shí)際的稀釋倍數(shù)，即可進(jìn)一步計(jì)算出蝦肉樣品中殘留磺胺類藥物的含量。

1.2.2蝦肉前處理。

取1支50 mL經(jīng)清洗、滅菌的離心管，依次加入已經(jīng)破碎均質(zhì)處理的蝦肉（2.0±0.05）g、50 μL 0.1 mol/L 氫氧化鈉、3.8 mL乙腈、2.0 mL乙酸乙酯，渦動(dòng)混勻，在室溫（20～25 ℃）條件下，以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min；精確移取3 mL離心后上層有機(jī)相加入到10 mL已經(jīng)滅菌處理的玻璃管，將其置于50～60 ℃水浴氮?dú)饬髦写蹈?，之后精確加入正己烷1.0 mL，渦動(dòng)60 s，再加復(fù)溶液1.0 mL，再渦動(dòng)60 s，于室溫（20～25 ℃）條件下，以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min；除去上部有機(jī)相，取下層水相留待分析。

1.2.3蝦肉中磺胺類藥物的測定。

試驗(yàn)前，需保證所有試驗(yàn)所用試劑回溫至20～25 ℃，且不起泡。從試劑盒內(nèi)取出2個(gè)反應(yīng)杯，將磺胺類藥物的標(biāo)準(zhǔn)品和蝦肉樣品對應(yīng)反應(yīng)杯進(jìn)行各自相應(yīng)編號，各做3個(gè)平行，記錄各自位置，依次加入磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品和樣品各20 μL、酶標(biāo)抗原100 μL、磁標(biāo)抗體50 μL，蓋板膜蓋板后于25 ℃下避光靜置30 min。取下蓋板膜，用吸水紙吸干各孔中的液體，繼而在各孔中加入250 μL洗滌工作液，每間隔10 s清洗1次，重復(fù)5次左右，直至清洗干凈，最后用吸水紙拍干。

在各孔中各加入100 μL已制備好的發(fā)光底物工作液，進(jìn)行覆膜處理后于37 ℃條件下避光孵育15 min，再按照每孔50 μL的用量加入終止液，混勻，設(shè)置反應(yīng)杯于波長450 nm處，即刻完成測定。

1.2.4蝦肉中磺胺類物質(zhì)含量的測定。

百分吸光率的計(jì)算。標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本對應(yīng)吸光度值的平均值（雙孔）除以第1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值的平均值，再乘以100%[9]，即：

百分吸光率（%）=B/B0×100% （1）

式中，B為磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品或蝦肉溶液的平均吸光度值；

B0為1 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與蝦肉樣本磺胺類藥物濃度的計(jì)算。

分別對0、1、3、9、27、81 μg/L 6 個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法測定，以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率測定值為縱坐標(biāo)，磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品濃度（10-9）的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制磺胺類藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)，根據(jù)線性方程計(jì)算IC50。將所測定蝦肉樣本的百分吸光率測定值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本的實(shí)際濃度。

1.2.5磺胺類藥物化學(xué)發(fā)光測定試劑盒指標(biāo)檢測方法。

1.2.5.1靈敏度。

評價(jià)免疫法試驗(yàn)反應(yīng)靈敏度常用IC50值和最低檢測限表示，IC50值即為零標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度值的50%處對應(yīng)的藥物濃度，兩者數(shù)值的大小與試劑盒的靈敏程度成反比。樣品采集地區(qū)、種類、預(yù)處理方法等因素與最低限檢測有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，而IC50則不受樣本本身的影響，值相對不變[11]。兩者結(jié)合，可用于試驗(yàn)所用試劑盒靈敏度指標(biāo)的評價(jià)。

分別檢測20組空白蝦肉樣品，計(jì)算其所含磺胺類藥物的濃度，檢測限LOD=S+3SD（其中S為磺胺類藥物的濃度平均值，SD為標(biāo)準(zhǔn)差），根據(jù)下面公式（2）計(jì)算磺胺類藥物化學(xué)發(fā)光測定試劑盒檢測實(shí)際樣品的最低檢測限。

LOD=X+3nX2-（X）2n（n-1）（2）

式中，X為試驗(yàn)重復(fù)測定空白樣品的平均值；

n為試驗(yàn)測定樣品數(shù)量。

1.2.5.2特異性。

特異性用交叉反應(yīng)率表示，其是衡量抗體與各抗原決定簇結(jié)合能力強(qiáng)弱的指標(biāo)，試驗(yàn)用一定濃度范圍的磺胺類藥物類似物取代磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定其標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各藥物交叉反應(yīng)率[12]。交叉反應(yīng)率（%）=引起50%抑制的磺胺甲噁唑濃度/引起50%抑制的磺胺類似物濃度。

1.2.5.3精密度、準(zhǔn)確度。

精密度是反映測定方法對某一特定樣品重復(fù)測定所得結(jié)果的一致程度的指標(biāo)，其是評定化學(xué)發(fā)光試劑盒質(zhì)量最為基本的參數(shù)；準(zhǔn)確度是試驗(yàn)測定值與真實(shí)值間的符合性程度的指標(biāo)，這一指標(biāo)大小是通過樣品回收率計(jì)算所得[13]。

試驗(yàn)檢測為陰性的蝦肉樣本以2.0、4.0、8.0 μg/kg的添加量進(jìn)行磺胺類藥物的添加，各設(shè)6個(gè)平行，根據(jù)試劑盒設(shè)計(jì)方法進(jìn)行測定操作，計(jì)算樣品的回收率。

1.2.5.4磺胺類藥物化學(xué)發(fā)光測定試劑盒與儀器檢測結(jié)果比較。

準(zhǔn)備20份隨機(jī)抽取的市場在售的蝦肉樣本，分別進(jìn)行試劑盒和儀器檢測結(jié)果對比。試劑盒檢測方法根據(jù)試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，高效液相色譜-質(zhì)譜法儀器檢測分析則參考《GBT 21316—2007 動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物殘留量的測定 高效液相色譜-質(zhì)譜法》（動(dòng)物組織中磺胺類藥物的檢出限為50 μg/kg）進(jìn)行操作[13]。

2結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

從圖1中可得，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=-36.56 x+77.156，方程相關(guān)系數(shù)R2=0.996 2，說明該試劑盒線性關(guān)系良好。

2.2磺胺類藥物化學(xué)發(fā)光試劑盒靈敏度的測定

由表1可知，磺胺類藥物化學(xué)發(fā)光快速檢測試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線IC50值的變化范圍為3.52～4.59 μg/L，IC50平均值4.04 μg/L。對空白蝦肉樣品進(jìn)行20次檢測，結(jié)果見表2。由表2可知，試驗(yàn)所用試劑盒對空白蝦肉的最低檢測限為1.04 μg/kg，供試樣品平均值0.63 μg/kg，標(biāo)準(zhǔn)差0.14。綜合以上2個(gè)數(shù)據(jù)可以得出，該試劑盒靈敏度高。

2.3磺胺類藥物化學(xué)發(fā)光試劑盒特異性的測定

磺胺類藥物化學(xué)發(fā)光試劑盒特異性測定結(jié)果如表3所示，試驗(yàn)所用11種抗體對磺胺類似藥物的交叉反應(yīng)率均較低，其中對磺胺二

甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲基嘧啶交叉反應(yīng)率均極低。綜上，得出該試劑盒具有較好的特異性。

2.4磺胺類藥物化學(xué)發(fā)光試劑盒準(zhǔn)確度及精密度的測定

在空白蝦肉樣品中，將磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺甲噻二唑、磺胺噻唑、磺胺間甲氧嘧啶、酞?；青邕?、磺胺吡啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲基嘧啶11種磺胺類藥物分別以2、4、8 μg/kg 3個(gè)濃度進(jìn)行添加，每個(gè)藥物濃度各設(shè)置5組平行試驗(yàn)，依照試劑盒提供的步驟方法進(jìn)行蝦肉樣品測定，每組試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次，分別計(jì)算變異系數(shù)和回收率，試驗(yàn)測定結(jié)果見表4。從表4中可知，蝦肉樣品的加樣回收率范圍在95.25%～104.50%，且變異系數(shù)均小于15%。與《農(nóng)業(yè)部文件》農(nóng)醫(yī)發(fā)〔2005〕17號附件2中有關(guān)試劑盒備案相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)相符。

2.5磺胺類藥物化學(xué)發(fā)光試劑盒與儀器檢測結(jié)果比較分析

2種分析方法測定結(jié)果見表5，以50 μg/kg為陽性判定線，當(dāng)樣品實(shí)際檢測結(jié)果低于這一判定線，則以“—”表示，高于或等于時(shí)則以實(shí)際測定值表示。從表5的檢測結(jié)果中可得：2種手段所得檢測結(jié)果相近，從4號樣品的檢測結(jié)果驗(yàn)證，試劑盒的檢測限較儀器更低，更易檢測出磺胺藥物低殘留的樣品。由此可知，該試劑盒法的檢測符合國家檢測標(biāo)準(zhǔn)且優(yōu)于儀器檢測。

3結(jié)論與討論

該試驗(yàn)采用的化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒測定蝦肉中11種磺胺類藥物，通過對其檢測方法進(jìn)行驗(yàn)證，并進(jìn)一步將試劑盒檢測結(jié)果與儀器檢測進(jìn)行對比。結(jié)果顯示，試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線IC50值的波動(dòng)范圍為3.52～4.59 μg/kg，試劑盒檢測靈敏度為1.04 μg/kg、交叉反應(yīng)率回收率為95.25%～104.50%，變異系數(shù)均小于15%，對樣品的檢測限低且遠(yuǎn)低于國家最高限量，表明該款化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度和精密度均較高，檢測結(jié)果與儀器分析結(jié)果接近。

該款化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒配套磁免疫全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光檢測儀檢測樣品測試速度高達(dá)120 測試/h，可實(shí)現(xiàn)連續(xù)不間斷進(jìn)樣，從加樣到測試整個(gè)環(huán)節(jié)高度自動(dòng)化，具有操作簡單、能耗低、設(shè)備投入少等優(yōu)勢，符合動(dòng)物源性食物中磺胺類殘留物的快速檢測需求。

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