小麥赤霉病菌對(duì)常用殺菌劑的抗性研究

周仁先

摘要 [目的] 研究小麥赤霉病菌對(duì)常用殺菌劑的抗性。[方法]測(cè)定從帶病麥穗標(biāo)本中分離得到的小麥赤霉病菌株對(duì)多菌靈、戊唑醇?xì)⒕鷦┑目顾幮裕⒗米贤夤庹T導(dǎo)得到抗性突變菌株，同時(shí)測(cè)定了抗藥突變菌株菌絲的生長(zhǎng)量，分析了抗性突變菌株產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)特性，最后提取并測(cè)定了脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）毒素含量。 [結(jié)果]安徽、江蘇地區(qū)的田間已檢測(cè)到小麥赤霉病菌抗性菌株，紫外光誘導(dǎo)也獲得了該病菌抗性菌株；抗性菌株在菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量方面與敏感菌株無(wú)顯著差異，但孢子萌發(fā)率遠(yuǎn)低于敏感菌株；樣品中的DON毒素含量隨著病情級(jí)別和病粒率的增加而增加，根據(jù)病粒率來(lái)測(cè)算DON毒素含量具有一定的實(shí)用性。[結(jié)論]該研究為小麥赤霉病的抗性治理提供對(duì)策。

關(guān)鍵詞 小麥；赤霉病菌；多菌靈；戊唑醇；抗性

中圖分類號(hào) S435.121.4+5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）21-0152-03

Abstract [Objective] To study resistance of Fusarium graminearum to common fungicides in wheat.[Method]The resistance of Fusarium graminearum in wheat isolated from diseased wheat ear specimens to carbendazim and tebuconazole fungicides was determined. At the same time， the mycelium growth of drugresistant mutant strain was determined， and the sporulation and spore germination characteristics of resistant mutant strain were analyzed. Finally， the content of deoxynivalenol （DON） toxin was determined.[Result] The resistant strain of Fusarium graminearum in wheat had been detected in the field of Anhui and Jiangsu， and the resistant strain was also induced by ultraviolet light， and there was no significant difference between the resistant strain and the sensitive strain in hyphae growth and sporulation. But spore germination rate was much lower than that of sensitive strains.The level of DON toxin in samples increased with the increase of disease grade and disease rate. It was practical to calculate the content of DON toxin according to the rate of diseased grains.[Conclusion]The study provides a solution for resistance management of Fusarium graminearum in wheat.

Key words Wheat；Fusarium graminearum；Carbendazim；Tebuconazole；Resistance

小麥?zhǔn)鞘澜缛蠊任镏?，在我?guó)分布廣泛，是我國(guó)主要的糧食作物，其種植面積僅次于水稻。小麥在種植過(guò)程中病害發(fā)生頻繁，造成嚴(yán)重的損失。目前小麥生產(chǎn)中常見(jiàn)的病害有小麥條銹病、小麥葉銹病、小麥稈銹病、小麥白粉病、小麥赤霉病、小麥紋枯病等。其中，小麥赤霉病是麥類作物上最重要的流行病害之一。小麥赤霉病在我國(guó)黃淮小麥主產(chǎn)區(qū)發(fā)生嚴(yán)重，部分地區(qū)收獲的小麥中赤霉病菌含量超標(biāo)嚴(yán)重。禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum），即小麥赤霉病菌，是我國(guó)乃至全世界小麥赤霉病的最主要致病菌。此類真菌破壞力很強(qiáng)，能在幾周時(shí)間內(nèi)摧毀大面積的高產(chǎn)作物，嚴(yán)重影響了谷類作物的生長(zhǎng)。在我國(guó)多菌靈、戊唑醇是防治該病害的主要藥劑，但由于此類殺菌劑的長(zhǎng)期使用，導(dǎo)致我國(guó)很很多地區(qū)出現(xiàn)了小麥赤霉病菌對(duì)多菌靈、戊唑醇等常見(jiàn)殺菌劑的抗性問(wèn)題[1-2]。隨著病菌抗藥性的日趨加強(qiáng)，我國(guó)很多地區(qū)赤霉病的發(fā)生也更加嚴(yán)重，同時(shí)也出現(xiàn)了污染問(wèn)題。為了杜絕藥劑的不合理使用、殺菌劑防治失效和小麥病害的大范圍發(fā)生，筆者檢測(cè)了小麥赤霉病菌對(duì)常用殺菌劑多菌靈、戊唑醇的抗藥性，并進(jìn)一步了解抗性發(fā)生的原因和類型，以期為小麥赤霉病的抗性治理提供對(duì)策。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

供試藥劑。98%多菌靈，由安徽廣信農(nóng)化股份有限公司生產(chǎn)；戊唑醇，由江蘇瑞德邦化工科技有限公司生產(chǎn)。

1.1.2

供試菌株。從河南、安徽、江蘇等地采集的揚(yáng)麥13、揚(yáng)麥15、揚(yáng)麥16、寧麥13帶病麥穗標(biāo)本，分離小麥赤霉病病原菌，獲得單孢菌株。

1.2 方法

1.2.1

小麥赤霉病菌抗藥性測(cè)定。將分離純化獲得的赤霉病菌菌株于25 ℃培養(yǎng)3 d后，用100 μL槍頭打成約5 mm的圓孔，再用滅菌后的牙簽分別接種至含有殺菌劑多菌靈、戊唑醇的PSA平板上，并做對(duì)照處理（不含殺菌劑），每個(gè)平板接種8株菌株。多菌靈和戊唑醇的濃度均為1、3、5、10、15 μg/mL，放置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d。用十字法測(cè)量菌落直徑，每處理重復(fù)3次，取平均值，計(jì)算其對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制百分率和相對(duì)防效，再根據(jù)相對(duì)防效的概率值和藥劑對(duì)數(shù)值的線性回歸分析，求出毒力回歸方程和抑制菌絲生長(zhǎng)的有效中濃度（EC50），并在含有不同濃度的PSA平板上測(cè)定其對(duì)相關(guān)菌株的最低抑制濃度（MIC）。

1.2.2

紫外光誘導(dǎo)抗性菌株。用5 mm孔徑的高溫滅菌槍頭打孔，用滅菌牙簽將隨機(jī)選取的10株敏感菌株接種至CMC培養(yǎng)基中，在25 ℃條件下振蕩培養(yǎng)4 d使之產(chǎn)孢；用經(jīng)滅菌的濾紙過(guò)濾收集孢子于離心管中，8 000 r/min離心5 min，棄上清，孢子沉淀在底部，用無(wú)菌水懸浮混勻，使孢子濃度約為105個(gè)/mL；吸取以上濃度的孢子液均勻涂布于多菌靈和戊唑醇的PSA平板上，將該平板距離紫外光源20 cm直接紫外光照射90 s，然后迅速轉(zhuǎn)入黑暗條件培養(yǎng)，8 d左右后長(zhǎng)出抗性突變菌株。

1.2.3

抗藥突變菌株菌絲生長(zhǎng)量測(cè)定。將經(jīng)紫外光誘導(dǎo)獲得的抗性突變菌株接種于PSA平板上，在25 ℃條件下培養(yǎng)3 d，測(cè)量菌落直徑，并計(jì)算出線性生長(zhǎng)速率。在100 mL PD培養(yǎng)液中接種4個(gè)菌碟，于25 ℃下120 r/min振蕩培養(yǎng)4 d，每處理3次重復(fù)，菌絲過(guò)濾、抽干后稱量干重。

1.2.4

抗性突變菌株產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)特性。選取在PSA平板上培養(yǎng)3 d的敏感菌株和抗突變菌株菌絲各20 mg，分別接種在100 mL 4%的綠豆湯培養(yǎng)基上，于25 ℃下200 r/min振蕩培養(yǎng)5 d使之產(chǎn)孢，采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算出產(chǎn)孢量。取適量孢子用無(wú)菌水稀釋10倍，采用清水萌發(fā)法于25 ℃下分別于8、16、22、26 h計(jì)算孢子的萌發(fā)率和芽管長(zhǎng)度。每處理3次重復(fù)。

1.2.5

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）毒素提取和測(cè)定。取2.0 g樣品粉末，置于50 mL離心管中，加入10 mL 乙腈∶水（V∶V）為84∶16的提取液，渦旋1 min，置于轉(zhuǎn)速200 r/min的搖床過(guò)夜，取2 mL上清液經(jīng)TRILOGYTC-T200型凈化柱凈化。取適量上述凈化后的樣品至自動(dòng)進(jìn)樣瓶，在流動(dòng)相為水∶甲醇∶乙腈（V∶V∶V）=90∶5∶5、紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)220 nm、流速1 mL/min、進(jìn)樣量15.0 μL、柱溫箱25 ℃、色譜柱 Agilent Eclipse XDB-C18分析柱（250.0 mm×4.6 mm，5.0 μm）的條件下，測(cè)定DON毒素含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥赤霉病菌的抗藥性

由圖1可知，從樣品上分離得到的赤霉病菌分別接種至5 μg/mL多菌靈和5 μg/mL戊唑醇的藥板上，多菌靈的藥板上敏感菌株完全被抑制，而抗性突變菌株可以生長(zhǎng)；戊唑醇的藥板上，敏感菌株具有一定的耐藥性，而在菌碟邊緣有微小菌絲長(zhǎng)出。可能是由于其對(duì)這2種藥劑的抗性機(jī)制不同造成的。

用此方法檢測(cè)了90株赤霉病菌。由表1可知，江蘇地區(qū)分離到的抗性菌株為50株，其中18株對(duì)多菌靈有明顯抗性，抗性比為36%；安徽地區(qū)分離到的抗性菌株為40株，其中4株對(duì)多菌靈有明顯抗性，抗性比為10%。對(duì)戊唑醇未檢測(cè)到產(chǎn)生抗性的菌株，可能是由于戊唑醇的作用機(jī)理與多菌靈不同所致。

2.2 紫外光誘導(dǎo)獲得的抗藥突變體

經(jīng)過(guò)紫外光誘導(dǎo)后，頻率為1×10-4 的菌株能在多菌靈藥板上生長(zhǎng)，但轉(zhuǎn)代3～4代后敏感性恢復(fù)，只有經(jīng)紫外光誘導(dǎo)后的抗藥突變體菌株經(jīng)轉(zhuǎn)代后仍能在多菌靈PSA平板上生長(zhǎng)。其對(duì)多菌靈的毒力回歸方程為Y=13.428 6+14.342 3X，相關(guān)系數(shù)r為0.966 7，EC50為14.21 μg/mL，EC50值是敏感菌株的26倍。

2.3 抗藥突變菌株的生長(zhǎng)情況

由圖2可知，敏感菌株和抗藥突變菌株在生長(zhǎng)速率方面無(wú)顯著差異。轉(zhuǎn)9代后，抗藥突變菌株的生長(zhǎng)速率超過(guò)敏感菌株?？顾幫蛔兙旰兔舾芯甑木z干重增長(zhǎng)率分別為0.178、0.165 mg/d，這與線性生長(zhǎng)速率趨勢(shì)一致。

2.4 敏感菌株和抗藥突變菌株產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)能力

由圖3可知，轉(zhuǎn)1代后敏感菌株和抗藥突變菌株的產(chǎn)孢量分別為2.0×106和3.0×106個(gè)/mL，轉(zhuǎn)13代后敏感菌株和抗藥突變菌株的產(chǎn)孢量分別為3.5×106和2.8×106個(gè)/mL。這表明轉(zhuǎn)代使抗藥突變菌株的產(chǎn)孢能力下降，敏感菌株的產(chǎn)孢能力略有升高。當(dāng)敏感菌株的孢子萌發(fā)率為100%時(shí)，抗藥突變菌株僅為57.0%。敏感菌株和抗藥突變菌株在16 h時(shí)孢子萌發(fā)的芽管長(zhǎng)度分別為0.017、0.028 mm；在22 h時(shí)，分別為0.034和0.078 mm。

2.5 產(chǎn)DON毒素能力

設(shè)定濃度分別為0、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L 7種DON毒素標(biāo)準(zhǔn)樣，采用HPLC進(jìn)樣檢測(cè)，得到相應(yīng)的峰面積，再利用各濃度及其對(duì)應(yīng)的峰面積得出線性回歸方程。由圖4可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=19.259X，R2=0.996 9。由此可知，抗藥突變菌株的樣品中DOC毒素含量較敏感菌株下降了2.5倍。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

該試驗(yàn)檢測(cè)了菌株對(duì)小麥赤霉病菌常用殺菌劑多菌靈和戊唑醇的敏感性特性。通過(guò)紫外光誘導(dǎo)獲得抗藥突變菌株，抗藥突變菌株與敏感菌株在菌絲干重、生長(zhǎng)速率和產(chǎn)孢能力等方面均無(wú)顯著差異，但轉(zhuǎn)代后的抗藥突變菌株在產(chǎn)孢能力、生長(zhǎng)速率方面與敏感菌株具有一定差異，這表明抗藥突變菌株可能難以穩(wěn)定生長(zhǎng)。通過(guò)比較抗藥突變菌株和敏感菌株的孢子萌發(fā)能力和芽管長(zhǎng)度，發(fā)現(xiàn)抗藥突變菌株的孢子萌發(fā)能力遠(yuǎn)低于敏感菌株。小麥赤霉病菌抗藥突變菌株由于繁殖能力低，導(dǎo)致其在田間的競(jìng)爭(zhēng)力也有所削弱。研究表明，小麥赤霉病菌抗藥突變菌株的致病力較敏感菌株有所下降，且紫外光誘導(dǎo)獲得抗藥突變菌株在轉(zhuǎn)代后很容易恢復(fù)敏感性，這可能是導(dǎo)致抗藥突變菌株在田間發(fā)生頻率低的主要原因[3-4]。

3.2 討論

小麥赤霉病是一種氣候性病害，其流行因素很多，但主要與開(kāi)春后初侵染的菌源量、揚(yáng)花期的溫濕度等有關(guān)。在我國(guó)，對(duì)小麥赤霉病的防治主要采用抗病品種和化學(xué)藥劑。目前我國(guó)對(duì)小麥赤霉病表現(xiàn)高抗的品種資源匱乏，加上小麥的抗病性和高產(chǎn)性無(wú)相互統(tǒng)一，使得赤霉病抗性小麥品種的選育進(jìn)程緩慢[5-8]。

小麥赤霉病的發(fā)生與菌源量和氣候條件有關(guān)，因此在防治過(guò)程中可以將這兩點(diǎn)作為改善對(duì)象。赤霉病菌主要是在禾谷類作物的殘?bào)w上越冬，小麥播種前要深耕滅茬盡量降低菌源量。此外，將小麥與非禾本科作物輪作，可以有效減輕赤霉病的發(fā)生。氣候方面，可以適當(dāng)提前播種，以便揚(yáng)花期提前，錯(cuò)開(kāi)有利于赤霉病發(fā)病的氣候條件[9-11]。

小麥赤霉病菌對(duì)多菌靈類苯并咪唑類殺菌劑產(chǎn)生抗藥性的最主要原因是此類藥劑與病原菌的親和性逐漸下降。多菌靈類苯并咪唑類殺菌劑會(huì)與靶標(biāo)真菌生物體內(nèi)的β-微管蛋白進(jìn)行特異性結(jié)合，干擾微管的裝配，由于微管在植物有絲分裂過(guò)程中具有重要作用，這就導(dǎo)致細(xì)胞正常的有絲分裂受到干擾，生長(zhǎng)受到抑制[12-13]。小麥赤霉病菌雖然對(duì)常用殺菌劑多菌靈普遍存在抗藥性，但試驗(yàn)過(guò)程中未發(fā)現(xiàn)戊唑醇的抗性菌株，這表明戊唑醇在田間具有較好的防治效果，可作為多菌靈的替代藥劑。

小麥赤霉病菌對(duì)多菌靈的抗性水平呈加快趨勢(shì)，江蘇和安徽地區(qū)抗性水平以每年約10%的速度增長(zhǎng)，尤其是在赤霉病大流行的年份。對(duì)于未檢測(cè)出抗性菌株的戊唑醇，對(duì)其進(jìn)行室內(nèi)抗性誘導(dǎo)，很難得到高抗菌株，唯一的抗性菌株僅處于低抗水平，這主要是由于戊唑醇作用方式的特殊性導(dǎo)致。基于此，筆者建議在小麥赤霉病流行地區(qū)，可以改變?cè)瓉?lái)的耕種模式，打破小麥赤霉病菌的循環(huán)路徑；播種前對(duì)籽粒進(jìn)行藥劑處理，適當(dāng)早播，盡量使小麥揚(yáng)花期避開(kāi)赤霉病的傳播；堅(jiān)持“見(jiàn)花打藥”，提早預(yù)防；當(dāng)多菌靈的抗性菌株比例達(dá)10%以上時(shí)，該藥劑的推薦劑量已不能有效防治小麥赤霉病，需要用其他藥劑代替。

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