朱長(zhǎng)保等

摘要{目的]初步探索水稻耐鹽機(jī)制，篩選關(guān)鍵基因。{方法]從公共基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)GEO（GeneExpressionOmnibus）搜索有關(guān)鹽脅迫下水稻基因表達(dá)的數(shù)據(jù)，利用TAC（TranscriptomeAnalysisConsole）篩選表達(dá)差異基因，對(duì)差異基因進(jìn)行GO（GeneOntology）富集分析、信號(hào)通路富集分析。{結(jié)果]在鹽脅迫下，CSR11、PL177兩種耐受型水稻與IR64、VSR156兩種敏感型水稻分別有3289、1934、1806、4426個(gè)基因表達(dá)。耐受型水稻中同時(shí)上調(diào)或下調(diào)的基因有288個(gè)，敏感型水稻中同時(shí)上調(diào)或下調(diào)的基因有330個(gè)。通過(guò)生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，耐受型水稻鹽脅迫主要影響代謝途徑、次級(jí)代謝產(chǎn)物合成、轉(zhuǎn)錄因子等方面。敏感型水稻鹽脅迫影響主要影響脅迫響應(yīng)、激素轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)代謝等方面。{結(jié)論]利用生物信息學(xué)方法能有效篩選目標(biāo)基因，并可為進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞水稻;鹽脅迫;差異基因表達(dá)

中圖分類號(hào)S? 511;Q786文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2018）36-0018-03

水稻是世界上最重要的糧食作物，世界上一半以上的人口以水稻作為主食，尤其在發(fā)展中國(guó)家。近年來(lái)由于工業(yè)污染的加劇，大量使用農(nóng)藥、化肥以及不合理灌溉等使土壤鹽堿化程度日益加重，鹽害已經(jīng)嚴(yán)重威脅糧食安全{1-3]。研究顯示，鹽對(duì)植物組織的傷害主要是離子毒害和滲透脅迫{4]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，研究人員希望能夠掌握鹽害下的作物生理響應(yīng)機(jī)制，以此為基礎(chǔ)，利用基因工程技術(shù)提高作物抗鹽能力，從而對(duì)合理開發(fā)和利用鹽堿土地資源，確保國(guó)家糧食安全具有重要意義?；蛐酒寡芯咳藛T能夠快速、高通量地了解植物在特定環(huán)境條件下的基因表達(dá)水平及變化{5]。鑒于此，筆者基于公共基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)GEO中鹽脅迫下水稻基因表達(dá)的芯片數(shù)據(jù)，通過(guò)生物信息學(xué)分析對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行篩選。

1材料與方法

1.1數(shù)據(jù)來(lái)源

登錄GEO（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下載水稻芯片數(shù)據(jù)（GSE21651、GSE58603），兩組數(shù)據(jù)都是選擇研究鹽脅迫下水稻葉片基因的表達(dá)。水稻類型分別為CSR11、PL177、IR64、VSR156，其中CSR11、PL177為耐受型水稻，IR64、VSR156為敏感型水稻{6-7]。

1.2方法

GEO數(shù)據(jù)利用TAC進(jìn)行芯片數(shù)據(jù)分析，獲得差異表達(dá)基因，選擇差異在2倍以上的表達(dá)基因（P<0.05）。利用PlantReMapGO富集分析（http：//plantregmap.cbi.pku.edu.cn/index.php）（P<0.01，Q<0.05），DAVID6.8（https：//david.ncifcrf.gov/）KEGG通路分析（P<0.05）。

2結(jié)果與分析

2.1鹽脅迫下不同水稻基因的表達(dá)

CSR11水稻在鹽脅迫下出現(xiàn)差異表達(dá)的基因是3289個(gè)，其中鹽脅迫誘導(dǎo)上調(diào)的基因有815個(gè)，下調(diào)的基因有2502個(gè)。IR64水稻在鹽脅迫下出現(xiàn)差異表達(dá)的基因是1806個(gè)，其中鹽脅迫誘導(dǎo)上調(diào)的基因有786個(gè)，下調(diào)的基因有1020個(gè)。PL177水稻在鹽脅迫下出現(xiàn)差異表達(dá)的基因是1934個(gè)，其中鹽脅迫誘導(dǎo)上調(diào)的基因有995個(gè)，下調(diào)的基因有939個(gè)。VSR156水稻在鹽脅迫下出現(xiàn)差異表達(dá)的基因是4426個(gè)，其中鹽脅迫誘導(dǎo)上調(diào)的基因有1400個(gè)，下調(diào)的基因有3026個(gè)（圖1）。在4種水

稻中，CSR11、PL177為耐受型水稻。經(jīng)研究分析發(fā)現(xiàn)，

CSR11、PL177表達(dá)重疊的基因有398個(gè)，但是同時(shí)上下調(diào)的基因?yàn)?88個(gè)，其中上調(diào)的基因有110個(gè)，下調(diào)的基因有178個(gè)。IR64、VSR156為敏感型水稻。分析發(fā)現(xiàn)，IR64、VSR156表達(dá)重疊的基因有542個(gè)，但是同時(shí)上下調(diào)的基因?yàn)?30個(gè)，其中上調(diào)的基因有249個(gè)，下調(diào)的基因有81個(gè)。

2.2鹽脅迫下2種水稻表達(dá)一致基因生物信息學(xué)分析

在耐受型、敏感型水稻中同時(shí)上調(diào)的表達(dá)基因有58個(gè)，同時(shí)下調(diào)的表達(dá)基因有25個(gè)（圖2）。說(shuō)明這類基因?qū)τ谒具m應(yīng)鹽脅迫至關(guān)重要，它們不受基因型的限制、不具有組織特異性。通過(guò)生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)這些表達(dá)基因富集以響應(yīng)溫度刺激為主、在信號(hào)通路上則主要在光合作用、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工上，包括熱激轉(zhuǎn)錄蛋白OsHsfA3（LOC_Os02g32590）、乙醇脫氫酶基因Adh1（LOC_Os11g10480）等基因（表1）。

2.3鹽脅迫下2種水稻特異性上調(diào)表達(dá)基因生物信息學(xué)分析

耐受型水稻特異性上調(diào)基因有52個(gè)，敏感型水稻特異性上調(diào)基因則有191個(gè)（圖2）。對(duì)耐受型水稻上調(diào)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，基因富集無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能是因?yàn)樘禺愋陨险{(diào)基因太少導(dǎo)致的。對(duì)信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)，其主要在代謝途徑、次級(jí)代謝產(chǎn)物合成過(guò)程中，包括乙醛脫氫酶OsALDH18B2（LOC_Os01g62900）、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶OsRBCS4（LOC_Os12g19470）等基因。對(duì)敏感型水稻上調(diào)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)基因富集以脅迫響應(yīng)為主，如溫度刺激、非生物刺激物質(zhì)化學(xué)反應(yīng)、滲透壓等功能，信號(hào)通路則主要參與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括活化蛋白激酶OsSAPK1（LOC_Os03g27280）、鋅指蛋白ZFP179（LOC_Os03g27280）、賴氨酸-酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氫酶OsLKR/SDH（LOC_Os02g54254）等基因（表1）。

2.4鹽脅迫下2種水稻特異性下調(diào)表達(dá)基因生物信息學(xué)分析

耐受型水稻特異性下調(diào)基因有153個(gè)，敏感型水稻特異性下調(diào)基因有56個(gè)（圖2）。對(duì)耐受型水稻下調(diào)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)基因富集主要在核蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、特異DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子等功能上，包括WRKY轉(zhuǎn)錄因子（LOC_Os01g09080，LOC_Os07g48260，LOC_Os09g25070）、bZIP轉(zhuǎn)錄因子（LOC_Os03g19370、LOC_Os05g49420、LOC_Os06g45140）、AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子（LOC_Os05g41760，LOC_Os01g58420）等基因，而信號(hào)通路無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)敏感型水稻下調(diào)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)基因富集以酶活性為主，如葡糖激酶、己糖激酶等，信號(hào)通路則主要參與到糖代謝途徑，包括己糖激酶OsHXK（LOC_Os01g71320、LOC_Os01g53930）等基因（表1）。

3結(jié)論與討論

鹽脅迫能夠誘發(fā)滲透脅迫和離子脅迫從而抑制植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育，在鹽脅迫下作物體內(nèi)的主要生理過(guò)程都會(huì)受到影響，如光合作用、蛋白質(zhì)合成、能量和油脂代謝等{8-9]。同時(shí)，鹽脅迫會(huì)誘導(dǎo)多個(gè)相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)提高植物的抗性，這些鹽脅迫耐性相關(guān)基因包括參與信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝相關(guān)的基因和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因等{10]。

該研究中耐受型、敏感型水稻的熱激轉(zhuǎn)錄蛋白OsHsfA（LOC_Os02g32590）、乙醇脫氫酶基因Adh1（LOC_Os11g10480）等基因表達(dá)一致，這類基因不具有組織特異性。熱激轉(zhuǎn)錄因子（Hsf）通過(guò)調(diào)控?zé)峒さ鞍祝℉SP）在植物脅迫響應(yīng)中起作用。Hsf基因在熱和鹽脅迫處理后顯著上調(diào)表達(dá)，超量表達(dá)OsHsfB2b轉(zhuǎn)基因植株對(duì)鹽和干旱敏感，抑制表達(dá)OsHsfB2b則提高對(duì)鹽和干旱的抗性{11]。

在耐受型水稻中乙醛脫氫酶OsALDH18B2、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶OsRBCS4等基因顯著上調(diào)，而WRKY轉(zhuǎn)錄因子（OsWRKY47、OsWRKY62、OsWRKY97）、AP2/EREBP家族中轉(zhuǎn)錄因子（MFS1、OsERF3/OsAP37）、bZIP轉(zhuǎn)錄因子（OsbZIP27、OsbZIP45、OsbZIP52）等顯著下調(diào)。研究表明，醛脫氫酶基因ALDH與逆境脅迫有關(guān)，在干旱和鹽脅迫下水稻中的OsALDH2-4、OsALDH3-4、OsALDH7、OsALDH10-1和OsALDH18-2表達(dá)上調(diào){12-13]。鹽脅迫下OsRBCS4的表達(dá)增加，OsRBCS4是調(diào)節(jié)植物光合作用的關(guān)鍵酶，參與植物光合作用和光呼吸過(guò)程，其表達(dá)量的變化可影響一些關(guān)鍵酶的表達(dá)。AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子與低溫、高鹽和干旱脅迫應(yīng)答等密切相關(guān)，鹽處理下OsERF3/OsAP37顯著下調(diào)表達(dá){14-15]。在篩選水稻的研究工作中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子WRKY參與逆境耐受的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，在高鹽、干旱、冷害、高溫等逆境因子脅迫中不同程度地被誘導(dǎo){16-17]。bZIP轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)ABA信號(hào)途徑在植物的非生物脅迫響應(yīng)中起著重要的作用{18]。在水稻中約有100個(gè)bZIP成員，OsABI5的表達(dá)受ABA及高鹽脅迫誘導(dǎo)，對(duì)該基因過(guò)表達(dá)發(fā)現(xiàn)其能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)鹽脅迫的更為敏感{19-20]。因此，耐受型水稻可能是通過(guò)促進(jìn)這些酶基因的表達(dá)，而抑制轉(zhuǎn)錄因子來(lái)提高自身的耐鹽能力。

該研究發(fā)現(xiàn)敏感型水稻中賴氨酸-酮戊二酸還原酶OsLKR/SDH、抗壞血酸過(guò)氧化物酶OsAPX2、細(xì)胞色素P450單加氧酶OsSL、鋅指蛋白基因ZFP179等顯著上調(diào)，而己糖激酶HXK顯著下調(diào)。賴氨酸是谷物中最缺乏的必需氨基酸，OsLKR/SDH是植物中控制游離賴氨酸含量的主要調(diào)節(jié)子之一{21]。在受到鹽脅迫時(shí)植物體內(nèi)的脯氨酸含量會(huì)迅速提高，調(diào)節(jié)植物細(xì)胞內(nèi)滲透壓與外界平衡，降低體細(xì)胞水勢(shì)，維持鹽脅迫條件下細(xì)胞的正常的滲透壓和生理代謝{22]。OsAPX2表達(dá)受空間和發(fā)育時(shí)期調(diào)節(jié)，受干旱、冷害和鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。OsAPX2通過(guò)清除活性氧保護(hù)幼苗免受非生物脅迫，在水稻生長(zhǎng)和發(fā)育上起著重要作用{23]。鋅指蛋白參與植物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫應(yīng)答的多種細(xì)胞生化過(guò)程。通過(guò)基因芯片分析鑒定了鹽脅迫應(yīng)答的鋅指蛋白基因ZFP179，ZF179過(guò)量表達(dá)能夠提高耐鹽水平，ZPF179在植物體內(nèi)對(duì)鹽脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，其耐鹽能力的增強(qiáng)在當(dāng)前的轉(zhuǎn)基因作物中非常有用{24-25]。HXK能磷酸化葡萄糖、果糖，甘露糖等，是聯(lián)系植物糖和激素的關(guān)鍵元件，通過(guò)對(duì)擬南芥進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)植物可能通過(guò)調(diào)節(jié)葡萄糖水平，參與ABA介導(dǎo)并依賴己糖激酶的糖途徑，實(shí)現(xiàn)從響應(yīng)逆境到抵御逆境的跨越{26-27]。因此，敏感型水稻可能是通過(guò)促進(jìn)基因以脅迫響應(yīng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)酶基因的表達(dá)，而抑制己糖激酶途徑來(lái)提高自身的耐鹽能力。

該研究比較鹽脅迫下不同水稻品種的基因應(yīng)答，篩選到相關(guān)的耐鹽基因，為耐鹽研究提供了新的方向。隨著水稻耐鹽機(jī)制的研究不斷深入，將會(huì)不斷發(fā)掘出耐鹽基因，人們可以利用轉(zhuǎn)基因、分子標(biāo)記等技術(shù)培育出耐鹽品種、從而為提高鹽堿地水稻的產(chǎn)量具有重要的指導(dǎo)意義。

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