藥用真菌牛樟芝的培養(yǎng)條件

金永浩

摘 要：這項實驗是通過液體靜止的方式來培養(yǎng)、觀察研究牛樟芝（Antrodia camphorata）在不同的時間段內(nèi)、在不同的溫度、不同濕度、不同濃度的碳氮源和不同營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基中激發(fā)子紅緣擬層孔菌（Fomitopsis pinicoLa（Swartz.：Fr.）Karst.）對牛樟芝之中的菌絲體中的總?cè)频臄?shù)量和質(zhì)量的影響。通過此項實驗，篩選出牛樟芝較為適合生長的培養(yǎng)基中各項元素的含量。具體的測量方法為紫外分光光度法，用紫外分光光度計測量，并繪制制作標準曲線，來測定其吸光度的大小，并通過這個數(shù)值，來計算出總?cè)频闹亓?。實驗表明：牛樟芝的菌絲體在優(yōu)化培養(yǎng)基中達到了最高的產(chǎn)量，其數(shù)值達到了3.31克；而在另一種GPY的培養(yǎng)基中產(chǎn)量則截然不同，在此培養(yǎng)基中，產(chǎn)量僅有0.45克。根據(jù)實驗得，在其他三種培養(yǎng)基中，牛樟芝菌絲體的產(chǎn)量都在3.0克左右徘徊，相差不大。在溫度這項數(shù)據(jù)中，牛樟芝在26℃時的產(chǎn)量達到了最大值，牛樟芝在26℃呈正態(tài)分布，離26℃越遠則產(chǎn)量越低，當溫度高于35℃時，則不能存活。在長達30天的培養(yǎng)周期中，gpy的總?cè)飘a(chǎn)量所占比最大，高達3.8%其他培養(yǎng)基則無明顯的變化。由此得出結(jié)果：牛樟芝在不同的培養(yǎng)基中所產(chǎn)出的總?cè)坪途z體都不同。其中在牛樟芝長勢最好的培養(yǎng)基環(huán)境成分為：葡萄糖、胰蛋白酶、五水硫酸鎂、氯化鉀，酵母浸粉。最適合的溫度為26℃，最適合的培養(yǎng)周期為25天。另外還發(fā)現(xiàn)，紅緣擬層孔菌似是催化劑一般，無論是對總?cè)七€是菌絲體都有促進作用。

關(guān)鍵詞：總?cè)疲痪z體；牛樟芝；紅緣擬層孔菌

1 緒論

牛樟芝，又稱之為陰陽菇。自打20世紀末期以來才被人們在中國臺灣發(fā)現(xiàn)。牛樟芝含有多種微量元素，迄今為止，人們從牛樟芝中成功分離并且發(fā)現(xiàn)了兩百多種微量元素，這些元素的種類很多，有大分子化合物，如多糖、蛋白質(zhì)等。還有小分子化合物，如各種芳香烴等，還有少量的微量元素。這些化合物對于治病的治療起到了絕佳的治療效果，相傳有起死回生的妙用。在人們的生活中更是可以加血人體的血液循環(huán)和新陳代謝，可以抵抗癌細胞的擴散，抑制血小板的凝結(jié)，降低血脂等眾多醫(yī)學(xué)作用。

自打這種藥材被發(fā)現(xiàn)至今，牛樟芝作為頂尖的藥引一直被醫(yī)學(xué)界所推崇。牛樟芝對生長條件的要求也極為苛刻，只有在牛樟樹上可以生長。相傳在早在18世紀，高山一族就用牛樟芝作為藥引，治病救人。但是牛樟芝由于其生長環(huán)境太為苛刻，必須生長在牛樟樹上，而牛樟樹也只能生長在牛樟木的陰面。牛樟木本身生長就極為困難，加上近些年來一些木頭販子對牛樟木的亂砍亂伐。使得牛樟木急劇減少，牛樟樹也隨之減少，牛樟芝被剝奪了生存環(huán)境，產(chǎn)量也持續(xù)下跌。

1.1實驗試劑和儀器

實驗試劑的選擇也是多樣的，比如說蔗糖，果糖，淀粉，乳糖，麥芽糖，葡萄糖等多糖試劑，還有甘油，木糖醇，牛肉蛋白胨，胰蛋白胨等。此外還有無水硫酸鎂，磷酸氫二鉀，硝酸鈉，高氯酸和次氯酸等化合物，還有各種醇類、醛類和芳香烴類。

實驗儀器為標準的又賽默飛世爾科技公司提供的紫外可見光光度計，MTFG-A型號的通風柜，中國昆山禾創(chuàng)超聲儀器公司提供的超聲波清洗儀器。另外還有標準制式的移液槍、燒杯、量筒、離心管、玻璃棒、小鑷子等實驗室用品。大型儀器還有海精宏實驗設(shè)備有限公司出產(chǎn)的電熱恒溫鼓風干燥箱、和型號為DNP-9052的電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海宜昌儀器紗篩廠所產(chǎn)的HHS-2型電子恒溫不銹鋼水浴鍋，上海越平科學(xué)儀器有限公司出產(chǎn)的YP5002型號的電子天平。此外還有美國MiLipore公司的建立的超純水系統(tǒng)，和蘇凈集團安泰公司的超凈工作臺。

1.2培養(yǎng)基的選擇

培養(yǎng)基的選擇主要有五種，他們分別是優(yōu)化培養(yǎng)基、PDA加富培養(yǎng)基、原生態(tài)PDA培養(yǎng)基、GPY培養(yǎng)基和常用的胡蘿卜培養(yǎng)基。其中優(yōu)化培養(yǎng)基的成分為：ph為7，無水硫酸鎂每升1.45克，磷酸二氫鉀每升0.736克，胰蛋白胨每升14.2克，酵母浸粉每升10克，葡萄糖每升20克。

PDA加富培養(yǎng)基的成分為ph為7，葡萄糖每升20克，磷酸二氫鉀每升1克，土豆每升200克。

而PDA培養(yǎng)基ph為7，葡萄糖每升20克，土豆每升200克，比PDA加富培養(yǎng)基少了營養(yǎng)物質(zhì)。

GPY培養(yǎng)基ph為7酵母膏為每升10g，蛋白胨為每升6g，葡萄糖為每升20克。

胡蘿卜培養(yǎng)基ph值為7，葡萄糖每升10克，胡蘿卜每升100克。

1.3培養(yǎng)方法

在進行實驗之前，要對所要培養(yǎng)的菌種進行活化。具體步驟為：首先把菌種從冰箱中取出來，第二步為將冷藏的材料恢復(fù)到室溫。第三步為采用無菌操作的方法將室溫的菌種接種到五種不同的培養(yǎng)基上。第四部為，挑選臨時培養(yǎng)基上成長狀況較好的菌落，將其接種到新的培養(yǎng)基中，如此重復(fù)3次，得到生長狀況較好的培養(yǎng)基。最后把其接種到恒溫的培養(yǎng)箱中，保持26℃條件不變，成長周期為21天，并定期觀察三萜化合物和菌絲體的重量變化情況。

1.4牛樟芝利用溫度實驗

在進行變量為溫度的實驗時，在對培養(yǎng)基進行優(yōu)化的基礎(chǔ)上，調(diào)整不同的溫度，將其分成6組，分別置入35度、30度、28度、26度、20度、15度的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)周期為21天，并且定期觀察三萜化合物和菌絲體的重量變化情況

1.5牛樟芝利用時間實驗

在進行變量為時間的實驗時，在對培養(yǎng)基進行優(yōu)化的基礎(chǔ)上，培養(yǎng)周期為21天，并且定期觀察三萜化合物和菌絲體的重量變化情況

1.6牛樟芝利用紅緣擬層孔菌實驗

在進行變量為紅緣擬層孔菌的實驗時，在對培養(yǎng)基進行優(yōu)化的基礎(chǔ)上，將實驗分為四組，第一組接種被滅活殺死失去活性的紅緣擬層孔菌，之后的每組實驗分別接種尚有活性的紅緣擬層孔菌、尚有活性的紅緣擬層孔菌和被滅活殺死失去活性的紅緣擬層孔菌的混合物。第四組則什么都不加，還用牛樟芝的原液，且每組實驗的接種量均為0.3毫升，培養(yǎng)周期為21天，并且定期觀察三萜化合物和菌絲體的重量變化情況

1.7牛樟芝菌絲體總?cè)a(chǎn)量的測定

當以上的實驗變量都經(jīng)過測量后，溫度、時間、不同培養(yǎng)基，是否接種紅緣擬層孔菌或者是牛樟芝原液等變量條件都一一測量后。在培養(yǎng)一個周期后，將培養(yǎng)基倒入網(wǎng)篩，并加以篩選，具體的方法是用吸水性的濾紙，充分的把培養(yǎng)基中的水分吸干。而后將其倒入容器并做好標識放入干燥箱之中進行干燥，干燥箱的溫度應(yīng)控制在70度左右，將水分完全蒸發(fā)后，對三萜化合物和菌絲體進行稱重測量。

而對于樣品溶液則要有不同的處理方式，菌絲體雖然產(chǎn)前千差萬別，但是所取的數(shù)量卻少之又少。所以通常用移液槍取大約0.3克，置于50毫升的容量瓶中，并用乙醇進行稀釋、定容，將其總數(shù)定在30毫升處。將超聲波調(diào)至30khz，進行超聲提取操作，持續(xù)兩小時，在整個操作過程中不得使用手晃動。等到結(jié)束后，放到試驗臺上等其自身沉降十小時，最后取上清液備用。

標準溶液的處理則較為簡單，稱取10毫克的齊墩果酸，采用甲醇將其稀釋、定容到30毫升。

在實驗過程中，沸水在蒸干時，由于存在水蒸氣的液化現(xiàn)象，由此會對實驗產(chǎn)生些許干擾，因此需要干燥箱來處理水蒸氣。待實驗完成后，取出試管，將試管迅速冷卻（冷卻方法為放入冰水混合物中），待冷卻完成后，加入5毫升乙酸，攪拌試管，使其混合充分。用紫外可見光光度計來測定其不同部位的吸光度，并記錄數(shù)據(jù)，以此來計算總?cè)频馁|(zhì)量。

在實驗完成后，要對實驗數(shù)據(jù)進行處理，繪制標準曲線。標準取消要以熊果酸的質(zhì)量為縱坐標，吸光度則作為縱坐標，標點，描繪曲線，根據(jù)曲線來計算總?cè)瀑|(zhì)量。

參考文獻

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