許申平　袁秀云　王默霏　崔波

摘 要 墨蘭種子無胚乳的結構特征使其自然萌發(fā)率極低，從而導致墨蘭種苗的繁殖速度不能滿足市場需求。本研究以成熟墨蘭種子誘導出的生長良好、性狀統(tǒng)一的根狀莖為材料，研究墨蘭根狀莖的增殖、綠芽分化及生根壯苗的情況。結果表明：MS培養(yǎng)基為最適合墨蘭根狀莖增殖的基本培養(yǎng)基，在該培養(yǎng)基中加入6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）1.0 mg/L與吲哚丁酸（IBA）0.1 mg/L時，根狀莖增殖的效果最好，增值系數(shù)達到10.33；在根狀莖分化階段，培養(yǎng)基中最佳的激素配比為6-BA 5.0 mg/L+萘乙酸（NAA）0.5 mg/L，分化系數(shù)達到6.43；生根壯苗階段，在不添加激素的生根培養(yǎng)基中，生根率達到100%。本研究建立了墨蘭組培快繁技術體系，可實現(xiàn)短時間內大量的種苗繁殖。

關鍵詞 墨蘭；組織培養(yǎng)；根狀莖；分化

中圖分類號 S682.3 文獻標識碼 A

Abstract The propagation of C. sinense is greatly restricted by the low seed germination rate due to immature embryo and no endosperm under natural conditions. In this study， the rhizomes of well grown and uniformity induced by seeds in C. sinense were used as the materials. The influence of different plant growth regulators on culture in vitro of C. sinense was studied. The results showed that the optimum basic medium for the multiplication and growth of the rhizomes was MS medium， and the best hormone combinations of multiplication was 6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L， with a multiplication rate of rhizomes up to 10.33. The optimum plant growth regulator combination for differentiation of rhizomes was 6-BA 5.0 mg/L+ NAA 0.5 mg/L， with a regeneration rate 6.43. All buds produced roots on basic medium with no plant hormone on MS medium. The present study established an efficient propagation system during industrial seedling production and provided a good theoretical and technological support for improving seedlings quality of C. sinense and its industrial production in a large scale.

Key words Cymbidium sinensis； tissue culture； rhizome； differentiation

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.05.015

墨蘭（Cymbiduim sinense）為蘭科（Orchidaceae）蘭屬（Cymbidium）多年生草本花卉，主要分布于中國臺灣、福建、云南、廣西和廣東等地區(qū)。因其葉形獨特，花色素雅，花香馥郁，素有“花中四君子”之一的美稱；深受人們的喜愛，具有很高的經(jīng)濟價值和觀賞價值。墨蘭和多數(shù)蘭科植物一樣，種子無胚乳，自然萌發(fā)率極低。傳統(tǒng)的墨蘭繁育多采用分株繁殖，但分株繁殖率不高，繁殖的時間較長，繁殖得到的植株還容易引起病毒，不能實現(xiàn)墨蘭大批量生產以滿足市場的需求。墨蘭種苗的繁殖速度慢是影響墨蘭產業(yè)興起的重要因素之一。

隨著組織培養(yǎng)技術的發(fā)展，該技術已成為墨蘭進行大量繁殖的重要手段[2-3]。早在80年代，Hasegawa等[4]就報道了分別用種子和莖尖進行墨蘭的組織培養(yǎng)。隨后，國內外開展了一系列墨蘭組織培養(yǎng)的研究。外植體的選擇主要涉及根狀莖[5]、種子[6-7]、莖尖[7]、幼葉[8]和花芽[7]等。后續(xù)的研究多以根狀莖為外植體。在墨蘭組織培養(yǎng)的研究中，常見的培養(yǎng)基有1/2 MS、MS、花寶1號、花寶2號、ZW和KC[9]，但對于最優(yōu)基本培養(yǎng)基目前并沒有統(tǒng)一的標準。鄭艷艷等[10]認為，在根狀莖的增殖試驗中，花寶1號和花寶2號混合使用時明顯好于MS培養(yǎng)基；而丁雪珍等[11]認為最適于墨蘭根狀莖增殖的基本培養(yǎng)基為1/2 MS。關于激素的使用，目前涉及較多的有6-BA、NAA、KT、IBA、TDZ等，但關于激素的最適劑量并不統(tǒng)一，如在墨蘭根狀莖增殖研究中，施福軍等[9]認為2.0 mg/L 6-BA和1.0 mg/L

NAA較適宜墨蘭根狀莖增殖培養(yǎng)；鄭艷艷等[12]認為添加2.0 mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA時根狀莖的增殖效果最佳；丁雪珍等[11]認為2.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L

NAA組合對墨蘭的增殖效果最好；墨蘭的增殖系數(shù)基本在8左右。在墨蘭根狀莖分化綠芽的研究中，有研究認為6-BA 0.5～1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L的MS培養(yǎng)基中，誘導芽分化的效果最佳[13]；傅雪琳等[14]認為綠芽分化最佳的激素配比為5.00 mg/L 6-BA+0.50 mg/L NAA；陳蘭芬等[15]認為墨蘭根狀莖分化的最適培養(yǎng)基為MS+0.1 mg/L KT+1.0 mg/L NAA。在墨蘭生根壯苗的研究中，魯雪華等[13]認為在附加0.2 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基中，幼苗的生根效果最佳；項艷等[16]認為生根的最佳培養(yǎng)基為：1/2 MS+NAA 3.0 mg/L；黃顯進等[16]則認為MS+NAA 5.0 mg/L生根效果最好。

綜上所述，雖然墨蘭的組織培養(yǎng)和快速繁殖已經(jīng)取得了較大的進展，但研究結果并不統(tǒng)一，大部分研究僅涉及墨蘭組織培養(yǎng)的其中一個階段，如根狀莖的增殖、根狀莖分化成苗究、試管苗快速生根試驗研究等；即使是關于墨蘭組織培養(yǎng)技術體系的研究，仍然存在一些問題，如在培養(yǎng)過程中繁殖系數(shù)偏低、生長緩慢、繼代周期長等[18]。為了提高墨蘭繁育的效率，本研究在前期研究的基礎上，通過對墨蘭根狀莖增殖、綠芽分化及生根壯苗進行系統(tǒng)研究，以期建立一套適合墨蘭種苗工廠化生產的組織培養(yǎng)技術體系，為墨蘭大規(guī)模快繁生產提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

在無菌條件下，將成熟的墨蘭種子播種于1/2 MS+椰汁20%+瓊脂7.5 g/L+蔗糖20 g/L+活性炭1 g/L培養(yǎng)基上，誘導萌發(fā)根狀莖。60 d后，以誘導的生長良好、性狀統(tǒng)一的根狀莖為試驗材料。椰汁為原產海南的新鮮椰子直接提取；瓊脂購于福建省石獅市閩南瓊膠有限公司；墨蘭種子由鄭州師范學院生物研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 根狀莖增殖基本培養(yǎng)基的篩選 為了研究不同培養(yǎng)基對根狀莖增殖的影響，分別以MS、1/2 MS和花寶一號培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加25 g/L蔗糖、7.5 g/L瓊脂和2 g/L活性炭進行試驗，以篩選出最適根狀莖增殖的基本培養(yǎng)基。將生長良好、性狀統(tǒng)一的根狀莖切取1 cm左右，接入MS、1/2 MS和花寶一號這3種基本培養(yǎng)基中。每瓶接種5根，6瓶為 1 個重復，設3 個重復，60 d后觀察其生長情況，并算出每種培養(yǎng)基的增殖系數(shù)。

1.2.2 激素配比對根狀莖增殖培養(yǎng)的影響 以MS+25 g/L糖+7.5 g/L瓊脂+2 g/L活性炭為基本培養(yǎng)基，將種子誘導的根狀莖接種在附加6-BA和IBA的不同濃度配比的培養(yǎng)基上，6-BA的濃度分別是1.0、3.0、5.0 mg/L，IBA的濃度分別是0.1、0.3、0.5 mg/L，進行雙因素正交試驗，觀察根狀莖的增殖情況，以篩選最佳培養(yǎng)基。每瓶接種5根，每根

1 cm左右，6瓶為 1個重復，設3個重復，每種濃度共接種30根根狀莖，2個月后統(tǒng)計分化根狀莖數(shù)，并計算增殖系數(shù)。

1.2.3 根狀莖的綠芽分化 為探究不同激素配比對墨蘭根狀莖綠芽分化的影響，以MS+25 g/L糖+7.5 g/L

瓊脂為基本培養(yǎng)基，將誘導出的根狀莖接種到附加6-BA和NAA不同濃度配比的培養(yǎng)基上，6-BA的濃度分別是1.0、3.0、5.0 、7.0 mg/L，NAA的濃度分別是0.1、0.3、0.5 、0.7 mg/L，進行雙因素正交試驗。每瓶接種根狀莖5個，長度1 cm左右，每個濃度6瓶，設3個重復。60 d后根據(jù)根狀莖芽的分化情況統(tǒng)計出芽總數(shù)，觀察綠苗的長勢，并計算平均每個根狀莖的分化系數(shù)。

1.2.4 生根壯苗 為探究墨蘭根狀莖分化綠芽的最適培養(yǎng)基，將根狀莖誘導出的綠芽接種到附加不同激素配比的培養(yǎng)基上，以MS+25 g/L蔗糖+7.5 g/L瓊脂+2 g/L活性炭為基本培養(yǎng)基，其中6-BA的濃度分別是0、0.1、0.3 mg/L，NAA的濃度分別是0、0.3、0.5 mg/L，進行雙因素正交試驗。每瓶接種5個根狀莖分化的綠芽，每個濃度接種6瓶，設3個重復。

60 d后觀察綠芽的生長和生根情況，統(tǒng)計生根總數(shù)，并計算出每個芽生根數(shù)及生根率。

1.2.5 培養(yǎng)條件 試驗中組織培養(yǎng)室的培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照強度為1 500～2 500 lx，每天12～14 h。所有培養(yǎng)基的pH值介于5.8～6.2之間。

1.3 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析以Excel 2010和SPSS 22.0軟件進行，平均數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準誤（S.E.）表示，多重比較采用鄧肯氏新復極差檢驗法（Duncans multiple ranger test）。統(tǒng)計數(shù)據(jù)指標包括：根狀莖增值系數(shù)=新增根狀莖數(shù)/接種根狀莖數(shù)；根狀莖分化系數(shù)=分化芽總數(shù)/接種根狀莖數(shù)；綠芽生根數(shù)=生根總數(shù)/接種芽數(shù)，綠芽生根率=（生根芽數(shù)/接種芽數(shù)）×100%。

2 結果與分析

2.1 根狀莖增殖基本培養(yǎng)基的篩選

由表1可知，由于未添加激素，墨蘭根狀莖在MS、1/2 MS和花寶1號3種培養(yǎng)基中的增殖系數(shù)均比較低。其中，MS培養(yǎng)基中的根狀莖粗壯，且每個根狀莖的分枝最多，增殖系數(shù)為3.50；花寶1號培養(yǎng)基中的根狀莖生長狀態(tài)較好，每個根狀莖增殖的數(shù)量較多，增殖系數(shù)為3.16，但不及MS培養(yǎng)基中的根狀莖數(shù)；接入1/2 MS培養(yǎng)基中的根狀莖生長情況最差，增殖系數(shù)僅為2.02，最不適合根狀莖的生長?？梢姼鶢钋o最適合在MS中生長，因此，在后續(xù)的研究中均以MS為基本培養(yǎng)基。

2.2 不同濃度配比的6-BA與IBA對根狀莖增殖培養(yǎng)的影響

經(jīng)過2個月培養(yǎng)后，根狀莖分化培養(yǎng)的結果統(tǒng)計如表2所示。試驗1組6-BA 1 mg/L+IBA 0.1 mg/L的激素配比對根狀莖的增殖效果最顯著，根狀莖嫩綠、粗壯、生長較迅速且增殖的根狀莖數(shù)量較多，增殖系數(shù)可達12.33（圖1-A）；試驗2組6-BA 1 mg/L+IBA 0.1 mg/L的激素配比對根狀莖的增殖效果也較好，雖然增殖系數(shù)低于第1組，但增殖系數(shù)可達10.53；其它激素組合的根狀莖生長速度比較緩慢，長勢不好，比較細弱，且增殖數(shù)量較少。本試驗結果顯示，當6-BA的濃度增加時，根狀莖的增殖效果不好，而低濃度時根狀莖的分化率較高，可能是高濃度的6-BA對根狀莖的增殖有一定的抑制作用。

2.3 不同培養(yǎng)基對根狀莖芽分化的影響

由表3可知，將根狀莖接入分化芽培養(yǎng)基培養(yǎng)2個月后，試驗11組的出芽總數(shù)最高，30個根狀莖共分化出193個綠芽，分化系數(shù)達到6.43；試驗10組和12組對根狀莖的分化也有顯著的促進作用，分化系數(shù)分別達5.33和5.20；當6-BA的濃度高于或低于5 mg/L時，根狀莖的分化系數(shù)均出現(xiàn)下降的趨勢，這說明6-BA對促進墨蘭根狀莖芽的分化具有一定的濃度范圍，高于或低于這個范圍均不利于根狀莖芽的分化。因此，在基本培養(yǎng)基中添加6-BA 5 mg/L與NAA 0.5 mg/L時，根狀莖的綠芽分化效果最好，且分化的芽飽滿色綠（圖1-B）。

2.4 生根壯苗

將墨蘭根狀莖分化的綠芽接種到不同激素配比的培養(yǎng)基中，2個月后各處理的綠芽生根情況如表4所示。在不添加任何激素的MS+25 g/L糖+7.5 g/L瓊脂+2 g/L活性炭的基本培養(yǎng)基中，墨蘭的生根效果最好，每個綠芽平均生根8條，生根率達到100%，而且綠芽生長健壯（圖1-C）。隨著NAA濃度的增加，綠芽生根率降低，每個芽的平均根數(shù)也有所降低，當NAA的含量增加到0.5時，生根率為85%。但6-BA的附加顯著降低了綠芽的生根率，這說明在墨蘭綠芽生根壯苗的過程中隨著植物激素的增加幼苗生根率逐漸降低，因此，在墨蘭生根壯苗的培養(yǎng)基中不適宜添加6-BA和NAA。

3 討論

墨蘭的組織培養(yǎng)是其進行大量繁殖的重要手段，一般包括根狀莖的誘導、增殖、分化和生根壯苗四大步驟[19]。墨蘭的根狀莖誘導率高，既能方便保存又能快速地分化出芽和根，在墨蘭快繁體系中非常重要。目前，在大部分的墨蘭快繁研究中，均以根狀莖為試驗材料[9-10， 14]，本研究也以種子誘導的根狀莖為外植體，開展一系列的研究。不同基本培養(yǎng)基對墨蘭根狀莖增殖分化效果不同，以MS較適宜，這與以往的研究認為墨蘭需要無機鹽較高的培養(yǎng)基一致[20-21]。影響根狀莖增殖速度和芽分化率的因素較多，其中較為重要的有基本培養(yǎng)基類型、植物生長調節(jié)劑的種類及其使用濃度和培養(yǎng)條件。

大多數(shù)植物激素在調控植物生長發(fā)育過程中的作用比較復雜，同一種激素可調控多個發(fā)育過程，而同一個特定的發(fā)育過程需要多種不同激素的協(xié)同作用[22]。6-BA能誘導不定芽的產生，促進側芽生長和細胞分裂；IBA能促進細胞分裂與細胞再生，誘導形成不定根[2]。在本研究中，以6-BA 1 mg/L+IBA 0.1 mg/L激素配比誘導的根狀莖伸長生長速度遠大于增粗生長，且產生多個細小分枝，在提高墨蘭根狀莖分化率的同時有利于延緩高代繁殖根狀莖的老化，同時該激素配比使墨蘭根狀莖的增殖系數(shù)可達12.33，遠超過前人研究所得（8.3[11]、7.4[9]和5.9[23]等）。與前人的研究不同，本研究將IBA應用于墨蘭根狀莖的增殖，并取得了較好的增殖效果。在線藝春蘭的研究中發(fā)現(xiàn)0～3.0 mg/L范圍內，IBA促進根狀莖的生長較NAA效果好[23]，但對這一影響機理還有待于進一步研究。

在墨蘭根狀莖綠芽分化的研究中，較低的分化率增加了墨蘭組織培養(yǎng)的難度，大量研究結果表明，墨蘭根狀莖綠芽分化階段需要較高的細胞分裂素濃度和較低的生長素濃度，且二者比例合適，才能由脫分化階段轉入分化階段，進行綠芽再生[18]。本研究利用6-BA 5 mg/L與NAA 0.5 mg/L的激素配比，使墨蘭根狀莖綠芽分化系數(shù)達到6.43。這一結果進一步證實了高濃度的6-BA和低濃度的生長素有利于不定芽分化的結論。雖然這一激素配比與傅雪琳等[14]的研究一致，但其分化率僅為180%，導致這一結果的主要原因可能是墨蘭根狀莖增殖階段應用的外源激素不同，使得根狀莖內源激素積累的不平衡，影響了綠芽的分化階段。在墨蘭生根壯苗的研究中，以添加NAA的報道居多，但添加劑量各不相同，從0.2～5 mg/L[13， 16-17]都有報道，在本研究中，以基本培養(yǎng)基不添加任何激素最佳，生根率達到100%，這可能與蘭花葉根同生的特性相關。

總之，關于墨蘭的許多研究結果接近但又不一致，其一可能與墨蘭不同品種、不同外植體部位對培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件的要求不同；其二可能與墨蘭組織培養(yǎng)的階段性有關，目前大部分的研究，僅選擇根狀莖的誘導、增殖、分化和生根壯苗的其中一個階段進行研究，但不同階段激素的用量會通過在植物體內的積累影響下一階段的結果，而對于墨蘭系統(tǒng)性研究的報道并不多見。因此，本研究通過對墨蘭組織培養(yǎng)系統(tǒng)的研究，結果發(fā)現(xiàn)MS培養(yǎng)基為最適墨蘭根狀莖增殖的基本培養(yǎng)基，在該培養(yǎng)基中加入6-BA 1.0 mg/L與IBA 0.1 mg/L時根狀莖增殖的效果最好；在根狀莖分化階段，培養(yǎng)基中最佳的激素配比為6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L；生根壯苗階段，在不添加激素的基本培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)生根率可達100%。

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