潘紅 賴呈純 黃賢貴 范麗華 段長(zhǎng)青 李紹振

摘? 要? 以刺葡萄2個(gè)同質(zhì)不同型的愈傷組織細(xì)胞系為材料，研究不同處理因子對(duì)其花青素和原花青素合成能力的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，刺葡萄DLR細(xì)胞系具有高產(chǎn)花青素和原花青素的能力，在培養(yǎng)至45 d時(shí)，其花青素與原花青素的含量均達(dá)到最高值，分別為113.85 μg/g（FW）和 3 562.95 μg/g（FW）;低溫、高溫、肉桂酸、殼聚糖、紫外線、黑暗和KT等因子，對(duì)DLR細(xì)胞系花青素和原花青素的累積表現(xiàn)出不同的效應(yīng);其中，4 ℃低溫處理下，DLR細(xì)胞花青素的積累效果最佳，比對(duì)照提高了2.14倍;殼聚糖處理下，原花青素積累效果最佳，是對(duì)照的2.84倍。刺葡萄DLW細(xì)胞系不具有或極低的花青素和原花青素合成能力，處理因子調(diào)控對(duì)其作用效果不明顯。本研究的結(jié)論為進(jìn)一步進(jìn)行刺葡萄細(xì)胞花青素和原花青素合成調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞? 刺葡萄;愈傷組織;花青素;原花青素;合成調(diào)控中圖分類號(hào)? S663.1;TS255.1???? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2018.12.012

花青素是一類具有多個(gè)酚羥基的黃酮類化合物，廣泛存在于植物的葉、花、果實(shí)、種子、根塊中，可呈現(xiàn)橙色、紅色至藍(lán)色的水溶性天然色素^[1]。原花青素是植物中廣泛存在的多酚類化合物，在酸性介質(zhì)中加熱可形成花青素^[2]。研究表明，花青素和原花青素是天然的抗氧化劑，具有清除人體自由基、保護(hù)心血管、促進(jìn)細(xì)胞增殖、抗腫瘤、抗突變、抗炎、促進(jìn)視力等生物學(xué)活性，在人類健康保護(hù)方面發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用^[3-6]。目前市場(chǎng)上的花青素和原花青素主要是從植物中獲取，天然花青素和原花青素的合成不僅與遺傳基因相關(guān)，還與外界環(huán)境因子相關(guān)，生產(chǎn)受到很大的限制^[7-8]。葡萄中花青素和原花青素的含量較其他植物中高^[2]，但大量提取應(yīng)用勢(shì)必對(duì)生產(chǎn)帶來(lái)極大的壓力。隨著技術(shù)的不斷革新，植物細(xì)胞培養(yǎng)被認(rèn)為是獲得植物次生代謝產(chǎn)物的有效途徑^[9]。利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可以在可控的條件下，有目的地提高花青素和原花青素的含量，進(jìn)而進(jìn)行大規(guī)模工廠化生產(chǎn)。在植物細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程中，前體飼喂和誘導(dǎo)子一般具有高度的專一性，添加合適的代謝前體和誘導(dǎo)子可以提高細(xì)胞中次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量。有研究表明，代謝前體、誘導(dǎo)子和激素等對(duì)花青素和原花青素含量的積累存在差異^[10-11]。目前，未見刺葡萄愈傷組織花青素和原花青素生物合成調(diào)控的相關(guān)報(bào)道。為了探索前體飼喂和誘導(dǎo)子對(duì)刺葡萄細(xì)胞花青素和原花青素誘導(dǎo)的效果，本課題組在誘導(dǎo)并長(zhǎng)期保存的刺葡萄細(xì)胞系的基礎(chǔ)上，研究了培養(yǎng)時(shí)間、前體飼喂和不同誘導(dǎo)子等處理下刺葡萄細(xì)胞中花青素和原花青素含量變化情況，以期為定向調(diào)控刺葡萄細(xì)胞花青素和原花青素合成提供技術(shù)支持。

1? 材料與方法

1.1? 材料

以福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所葡萄研究中心長(zhǎng)期繼代保存的2個(gè)同質(zhì)不同型的刺葡萄愈傷組織細(xì)胞系DLR和DLW^[12]為實(shí)驗(yàn)材料。DLR細(xì)胞系穩(wěn)定呈紫紅色，DLW細(xì)胞系穩(wěn)定呈淺黃綠色。

1.2? 方法

1.2.1 ?不同階段的刺葡萄愈傷組織培養(yǎng)? 將刺葡萄愈傷組織DLR、DLW接入附加1.0 mg/L 2，4-D的MS固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 d時(shí)分別取樣。培養(yǎng)室溫度為25 ℃，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx，相對(duì)濕度50%～60%，每天光照12 h。設(shè)5次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2? 不同處理下的刺葡萄愈傷組織培養(yǎng)? 溫度處理：刺葡萄愈傷組織培養(yǎng)至24 d時(shí)，將其分別置入4 ℃、37 ℃的溫度條件下，培養(yǎng)24 h后取樣，并以培養(yǎng)室（25 ℃）培養(yǎng)的愈傷組織為對(duì)照。肉桂酸處理：將培養(yǎng)至24 d時(shí)的DLR、DLW愈傷組織置于濃度為40 mg/L的肉桂酸溶液中（肉桂酸溶液采用附加1.0 mg/L 2，4-D的MS液體培養(yǎng)基配制），在培養(yǎng)室中培養(yǎng)24 h后取樣。殼聚糖處理：將培養(yǎng)至24 d時(shí)的刺葡萄愈傷組織置于濃度為800 mg/L的殼聚糖溶液中，在培養(yǎng)室中培養(yǎng)24 h后取樣。暗培養(yǎng)處理：將刺葡萄愈傷組織于遮光條件下培養(yǎng)25 d后取樣。UV-B處理：將培養(yǎng)至24 d時(shí)的DLR、DLW愈傷組織置于紫外燈（0.15 W/m²）下照射3 h，再培養(yǎng)24 h后取樣。KT處理：將DLR、DLW愈傷組織接種到附加1.0 mg/L 2，4-D和0.5 mg/L KT的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)25 d。以上各處理除了暗培養(yǎng)外均在光照條件下培養(yǎng)，均以附加1.0 mg/L 2，4-D的MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)25 d的愈傷組織為對(duì)照，培養(yǎng)室溫度為25 ℃，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx，相對(duì)濕度50%～60%，每天光照12 h。實(shí)驗(yàn)均設(shè)5次生物學(xué)重復(fù)。刺葡萄愈傷組織收集過(guò)程去除培養(yǎng)基，用濾紙吸附多余水分，裝入塑封袋，液氮速凍后，放入–80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3? 花青素與原花青素含量測(cè)定? 參照賴呈純等^[12]報(bào)道的方法進(jìn)行刺葡萄愈傷組織花青素與原花青素含量的提取與測(cè)定。

1.3? 數(shù)據(jù)分析

采用Excel軟件處理數(shù)據(jù)，并利用DPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和方差分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 不同培養(yǎng)階段的刺葡萄細(xì)胞培養(yǎng)物花青素含量

2個(gè)刺葡萄細(xì)胞系DLR和DLW（圖1）在不同培養(yǎng)階段中花青素含量的變化如圖2所示。從圖2可以看出，DLW刺葡萄細(xì)胞中幾乎檢測(cè)不到花青素的存在，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程都維持在痕量的水平，含量在0.05～0.50 μg/g（FW）變化，這說(shuō)明DLW細(xì)胞系幾乎不合成花青素或沒(méi)有合成花青素的能力。隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，DLR刺葡萄細(xì)胞中花青素含量呈一個(gè)動(dòng)態(tài)的變化，類似M形變化趨勢(shì)，即先緩慢增加，20 d后快速增加，30 d后急劇增加，35 d形成一個(gè)高峰后開始快速下降，40 d降到低點(diǎn)，隨后又快速增加，45 d達(dá)另一個(gè)高峰，而后又迅速下降，一直持續(xù)到60 d，花青素含量在7.39～113.85 μg/g（FW）變化。35 d和45 d是DLR細(xì)胞系花青素含量累積的2個(gè)高峰，含量分別為109.04 μg/g（FW）和113.85 μg/g（FW），與其他階段的DLR細(xì)胞培養(yǎng)物花青素含量相比，差異極顯著（p<0.01）;含量最低值出現(xiàn)在培養(yǎng)的第10 天，僅為7.39 μg/g（FW）。這種雙峰的變化，可能與DLR細(xì)胞系花青素的累積不同的大寫字母表示差異極顯著（p<0.01），不同的小寫字母表示差異顯著（p<0.05）;DLW由于數(shù)值太小，不進(jìn)行差異顯著性分析。

與細(xì)胞的衰老存在相關(guān)性，當(dāng)前期細(xì)胞生長(zhǎng)到35 d時(shí)，花青素的累積達(dá)到高峰，35 d后隨著細(xì)胞衰老，花青素合成受阻，部分降解，40 d后抗衰老的機(jī)制運(yùn)行，花青素合成再次激活，45 d花青素含量又形成一個(gè)高峰，之后隨著細(xì)胞的進(jìn)一步衰老，花青素合成再次受阻，并且快速降解。

2.2? 不同處理下刺葡萄細(xì)胞培養(yǎng)物花青素含量

在不同處理?xiàng)l件下，刺葡萄DLR、DLW細(xì)胞系花青素含量變化情況如圖3所示。DLW細(xì)胞系其花青素的含量并沒(méi)有明顯增加，仍維持在極低水平，在0.35～0.65 μg/g（FW）變化，這說(shuō)明不同因子處理對(duì)DLW細(xì)胞系花青素合成的誘導(dǎo)是無(wú)效的。對(duì)于DLR細(xì)胞系來(lái)說(shuō)，不同因子的處理對(duì)其細(xì)胞培養(yǎng)物花青素含量的累積有很大影響，其中，4 ℃低溫處理對(duì)花青素累積的促進(jìn)效果最好，其花青素含量為46.05 μg/g（FW），比對(duì)照的21.47 μg/g（FW）提高了約2.14倍;殼聚糖處理后，花青素含量為39.31 μg/g（FW），比對(duì)照提高了約1.83倍;高溫37 ℃處理也能較大幅度提高細(xì)胞中花青素含量，為35.16 μg/g（FW），比對(duì)照增加了1.64倍;UV處理花青素含量為26.44 μg/g（FW），比對(duì)照增加了1.23倍;肉桂酸處理下，細(xì)胞花青素含量不升反降，可能是加入肉桂酸代謝前體會(huì)改變花青素合成途徑中次生產(chǎn)物的累積水平;0.5 mg/L KT處理對(duì)DLR細(xì)胞花青素

2.3? 不同培養(yǎng)階段的刺葡萄細(xì)胞培養(yǎng)物原花青素含量變化

不同的培養(yǎng)時(shí)間對(duì)原花青素含量的積累具有較大的影響。從圖4可以看出，刺葡萄DLW細(xì)胞系原花青素含量在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中都維持在一個(gè)很低的水平，檢測(cè)到的原花青素含量在52.56～ 130.48 μg/g（FW）。DLR細(xì)胞系持續(xù)的培養(yǎng)過(guò)程中，原花青素含量變化呈現(xiàn)為倒V形，檢測(cè)到的原花青素含量在577.33～3 562.95 μg/g（FW）： 10～15 d略微下降，之后持續(xù)快速上升， 35～40 d時(shí)有一個(gè)停滯階段，40～45 d又開始迅速增加，45 d原花青素含量達(dá)到最大累積量，為3 562.95 μg/g（FW），而后又?jǐn)嘌率降匮杆俳档停敝?0 d。這種變化趨勢(shì)可能是與DLR細(xì)胞的生長(zhǎng)和衰老相適應(yīng)的結(jié)果，35 d后細(xì)胞開始衰老，衰老的反應(yīng)機(jī)制到40 d后開始建立，45 d后細(xì)胞大部分進(jìn)入衰老，合成受阻并且次生產(chǎn)物開始降解，導(dǎo)致其原花青素的含量持續(xù)下降。

2.4? 不同處理下刺葡萄細(xì)胞培養(yǎng)物原花青素含量變化

經(jīng)過(guò)不同因子處理，刺葡萄DLR、DLW細(xì)胞系原花青素含量變化如圖5所示。對(duì)于DLW細(xì)胞系，不同因子的處理并不能增加其原花青素含量，說(shuō)明這些處理對(duì)于其原花青素的合成是無(wú)效的。對(duì)于DLR細(xì)胞系來(lái)說(shuō)，各因子的誘導(dǎo)效果差異較大，處理后對(duì)刺葡萄DLR細(xì)胞培養(yǎng)物原花青素的累積效果為：殼聚糖>KT>37 ℃>肉桂酸> 4 ℃>UVB>CK>暗培養(yǎng)。濃度為800 mg/L的殼聚糖對(duì)DLR細(xì)胞培養(yǎng)物原花青素累積效果最好，含量可達(dá)到3 742.96 μg/g（FW），比對(duì)照[1 317.85 μg/g（FW）]增加了2.84倍;其次為KT，原花青素含量為3 311.89 μg/g（FW），比對(duì)照增加了2.51倍左右;4 ℃、37 ℃和肉桂酸處理也能顯著增加原花青素含量，增加1.6倍以上。這說(shuō)明殼聚糖、激素、37 ℃、肉桂酸和4 ℃處理均可以增加刺葡萄細(xì)胞原花青素的合成與累積;紫外光對(duì)刺葡萄細(xì)胞原花青素的合成有一定的抑制作用，而暗培養(yǎng)對(duì)其原花青素的合成有強(qiáng)烈的抑制作用，說(shuō)明光照對(duì)原花青素的合成同樣是必需條件。

2.5? 刺葡萄細(xì)胞花青素和原花青素合成的關(guān)聯(lián)性分析

植物花青素和原花青素的合成經(jīng)由了次生代謝苯丙烷類途徑和類黃酮途徑，從形成無(wú)色花青素后出現(xiàn)分支^[13-14]。就刺葡萄DLW細(xì)胞系而言，其不能形成花青素，也幾乎不合成原花青素。對(duì)于刺葡萄DLR細(xì)胞系，在連續(xù)的2個(gè)月培養(yǎng)過(guò)程中，其花青素出現(xiàn)2個(gè)累積高峰，而原花青素只有1個(gè)累積高峰，含量最高峰都出現(xiàn)在培養(yǎng)的第45天。在各種因子處理的情況下，DLR細(xì)胞代謝前體肉桂酸會(huì)抑制花青素的合成，但卻顯著地促進(jìn)原花青素的合成;激素KT處理對(duì)DLR細(xì)胞花青素的合成沒(méi)有顯著的促進(jìn)作用，卻可以極顯著地增加其原花青素的合成;紫外光處理可以顯著地促進(jìn)花青素的合成，但對(duì)原花青素的累積作用效果不明顯。這種變化情況說(shuō)明，花青素和原花青素的合成與累積具有一定的關(guān)聯(lián)性，其合成和累積的過(guò)程受諸多因素的影響，這有待進(jìn)一步深入的研究。

3? 討論

本研究對(duì)2個(gè)刺葡萄細(xì)胞系花青素和原花青素含量進(jìn)行了分析，刺葡萄DLW細(xì)胞系花青素與原花青素含量極少，且定向調(diào)控也無(wú)明顯作用，這說(shuō)明其不適合用于生產(chǎn)花青素和原花青素。DLR細(xì)胞系具有較強(qiáng)的合成花青素和原花青素的能力，在培養(yǎng)45 d時(shí)，花青素和原花青素的含量均達(dá)到峰值。不同的調(diào)控因子對(duì)DLR細(xì)胞系花青素和原花青素的合成具有較大影響，但作用的效果存在較大差異。

4 ℃低溫處理對(duì)提高花青素的積累效果最明顯，低溫能夠誘導(dǎo)花青素積累，使花青素含量提高，這一現(xiàn)象在蘋果^[15]、紅橙^[16]、菊花^[17]等植物中都得到了驗(yàn)證。37 ℃高溫處理下DLR細(xì)胞中花青素和原花青素的含量明顯增加，雖然有研究表明高溫抑制了合成花青素基因的表達(dá)^[15]，使植物分解代謝加劇，導(dǎo)致花青素合成受抑制或分解增加^[18]，但也有研究報(bào)告顯示花青素生物合成基因的mRNA積累和UFGT的酶活性在高溫下不受抑制^[19]。殼聚糖處理的刺葡萄DLR細(xì)胞，表現(xiàn)出最強(qiáng)的原花青素合成能力，培養(yǎng)25 d的細(xì)胞培養(yǎng)物，其原花青素含量比對(duì)照組提高了2.84倍。殼聚糖對(duì)次生代謝產(chǎn)物的積累作用，在許多研究中都得以證實(shí)^[20-22]。光是影響植物的重要環(huán)境因子之一，植物通過(guò)光受體感知并傳遞光信號(hào)，調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的各個(gè)過(guò)程^[23]。在離體培養(yǎng)的細(xì)胞中，光通過(guò)激活花青素代謝途徑中的相關(guān)酶基因的表達(dá)，對(duì)花青素苷合成進(jìn)行調(diào)控，VvmyBA1是花青素生物合成的調(diào)控基因，在避光的條件下，植物細(xì)胞內(nèi)源性ABA含量降低，VvmyBA1的表達(dá)被抑制^[24]。CHS、DFR、UFGT等都屬于光調(diào)節(jié)酶，以光敏色素為光受體^[25-26]。刺葡萄細(xì)胞在暗培養(yǎng)的條件下，其花青素和原花青素的含量與對(duì)照相比分別減少了94%和55%。這說(shuō)明光對(duì)刺葡萄細(xì)胞花青素和原花青素的積累具有明顯的刺激作用，DLR細(xì)胞系屬于光敏感型。紫外光是類黃酮生物合成的有效促進(jìn)因子^[27-28]，刺葡萄DLR細(xì)胞在紫外光處理下，花青素含量顯著增加，而對(duì)原花青素合成有一定的抑制作用，這種現(xiàn)象的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。肉桂酸是花青素、原花青素合成途徑的必要物質(zhì)之一^[29-30]，在肉桂酸處理DLR細(xì)胞系中，發(fā)現(xiàn)其花青素合成能力受抑制，而能促進(jìn)原花青素的合成。激素是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子，在DLR細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，添加KT的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)物，在同一時(shí)間內(nèi)比未添加KT培養(yǎng)的刺葡萄愈傷組織DLR顏色紅，呈深紅色，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，KT對(duì)刺葡萄愈傷組織DLR花青素含量的積累并沒(méi)有顯著性影響，但原花青素含量的積累是對(duì)照的2.51倍。以上這些現(xiàn)象的作用機(jī)制，均有待進(jìn)一步的深入研究。

以上分析說(shuō)明，處理因子的濃度或處理時(shí)間等對(duì)植物細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物的積累具有一定的影響作用。過(guò)低的濃度、過(guò)短的處理時(shí)間都可能達(dá)不到誘導(dǎo)效果，高濃度的誘導(dǎo)子與長(zhǎng)時(shí)間的處理可能對(duì)細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物的積累具有一定的拮抗作用。所以處理因子的使用量與處理時(shí)間也有一定的要求。雖然本研究未對(duì)各處理因子的使用濃度或處理時(shí)間做深入研究，但為后續(xù)研究提供了方向，為進(jìn)一步開展刺葡萄細(xì)胞花青素和原花青素合成定向調(diào)控與基因表達(dá)的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

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