紅掌細菌性疫病病原菌遺傳多樣性的RAPD和Rep—PCR分析

陳艷梅 高月榮 尹俊梅 ?？『?/p>

摘 要 由地毯草黃單胞菌花葉萬年青致病變種引起的細菌性疫病是紅掌生產(chǎn)中最具破壞性的病害。本研究對來自全國8個省市主產(chǎn)區(qū)的93個紅掌細菌性疫病菌株，采用RAPD和Rep-PCR（ERIC、BOX、REP）分子標記進行了遺傳多樣性分析。篩選出的13個RAPD引物共擴增出131個清晰、重復性好的條帶，而Rep-PCR共擴增出65個條帶，所有位點多態(tài)性比率為100%?；赗APD和Rep-PCR結(jié)果計算的群體遺傳距離顯著相關(guān)，綜合2種標記類型的分型結(jié)果進行UPGMA聚類分析，表明我國紅掌細菌性疫病具有高度的遺傳多樣性，在遺傳相似性系數(shù)范圍0.519 1～0.984 7，在0.63水平時可以將所有菌株劃分為3個組群，分別包括58、28、7個個體，病菌群體的遺傳多樣性與其寄主品種、地理來源沒有明顯相關(guān)性。本研究為紅掌細菌性疫病監(jiān)測和抗病育種提供了科學依據(jù)。

關(guān)鍵詞 紅掌；細菌性疫??；遺傳多樣性；RAPD；Rep-PCR

中圖分類號 S436.8 文獻標識碼 A

Abstract Bacterial blight is the most devastating disease of anthurium caused by Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae （Xad）. In this study， ninety-three isolates of Xad from different geographical locations in China were analyzed for genetic diversity using RAPD and Rep-PCR （ERIC， BOX， REP）. A total of 131 clear and reproducible bands were amplified from 13 selected RAPD primers， and 65 bands were amplified by Rep-PCR. The polymorphism rate of all sites was 100%. Based on the fingerprint data， cluster analysis were performed by using the unweighted pair group method， arithmetic average （UPGMA） program， which showed a high genetical diversity among the isolates， with genetic similarity varied from 0.519 1 to 0.984 7. At a similarity of 0.63， all isolates were grouped into three genetic groups （Ⅰ-Ⅲ）， including 58， 28， 7 isolates， respectively. Moreover， no significant correlation between genetic diversity and geographical origin of the isolates. This present data would provide a scientific support for blight monitoring and resistance breeding in anthurium.

Keywords Anthurium； bacterial blight； genetic diversity； RAPD； Rep-PCR

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.09.020

紅掌（Anthurium andraeanum Lind.）隸屬于天南星科Araceae花燭屬Anthurium，是一種花、葉兼具觀賞價值的重要盆花與切花植物。我國目前已經(jīng)成為全球最大的盆花產(chǎn)地和消費市場，年產(chǎn)3 000萬盆左右，產(chǎn)值大于10億元。但是，紅掌細菌性疫病一直是產(chǎn)業(yè)的一大威脅，在我國主要的紅掌產(chǎn)區(qū)均被發(fā)現(xiàn)[1-4]。該病害由地毯草黃單胞菌花葉萬年青致病變種Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae （簡稱Xad） 引起，病原菌主要通過葉片侵染，從葉緣水孔或傷口入侵，造成局部侵染，葉片黃花壞死；后期進入到莖或維管束組織中，堵塞維管束，造成系統(tǒng)侵染，引起葉片脫落，失水死亡[5]。該病害侵染性強、潛伏期長、爆發(fā)迅速，比較難以防治[6-7]。

分析病原群體的遺傳結(jié)構(gòu)，探尋病原菌遺傳分化的多樣性，對于認識病害發(fā)生傳播的因素、危害現(xiàn)狀及制定針對性的防治措施，有著積極的指導作用。Khoodoo等[8]對分離自多個國家紅掌等植物的25個Xad菌株，進行RAPD遺傳變異分析，顯示遺傳相似性在10%～65%之間，供試菌株可以劃分為4個類群。Donahoo等[9]對來自美國佛羅里達、夏威夷等地天南星科植物的Xad菌株基因組DNA進行Rep-PCR（BOX、ERIC、REP-PCR）擴增分型，采用UPGMA法將菌株劃分為4個遺傳類群，發(fā)現(xiàn)遺傳聚類和植物物種來源存在一定的相關(guān)性。國內(nèi)，龍那葩[10]采用5對AFLP引物，對采集自浙江省內(nèi)51個Xad菌株檢

測，共擴增出64條多態(tài)性條帶，遺傳聚類在相似性70%上將所有菌株劃分為兩個類群。付貝等[11]采用Rep-PCR技術(shù)對來自廣東省主要紅掌種植的9個市區(qū)27個品種的66個Xad菌株進行遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示在相似水平為0.85時，可以分為14個遺傳組，這表明廣東紅掌細菌性疫病菌遺傳分化明顯且具多樣性。因此，在紅掌細菌性疫病的分子檢測、品種抗性鑒定以及紅掌種植過程中，要考慮病菌的遺傳多樣性，以及所導致的致病性分化。

我國紅掌商品花銷售終端分布全國，而產(chǎn)地仍相對集中在部分省區(qū)，且種植戶多而分散，帶菌種苗、商品花和栽培基質(zhì)的大范圍傳播，給病原菌的擴散提供了便利。為了了解我國主要的紅掌分布區(qū)細菌性疫病菌的遺傳概況，本研究室在2010—2014年陸續(xù)從全國多地采集，分離、鑒定了93個Xad菌株[12]，本研究在此基礎(chǔ)上，采用RAPD 和Rep-PCR對這些代表性菌株進行基因組DNA分型和群體遺傳多樣性分析，以期了解我國紅掌細菌性疫病病原群體現(xiàn)狀，為分析成因及有效防治提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及其來源

供試菌株93個，分別于2010—2014年采自四川、海南、廣東、云南、山東、北京、浙江及臺灣等8個省市，遍布全國主要的紅掌種植區(qū)（表1）。病原菌分離純化后，分別經(jīng)過致病性接種、16s rRNA基因測序、特異性SCAR或LAMP分子標記檢測等，進行了準確鑒定[12]。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取與引物合成 將保存在80 ℃的Xad菌株接入YPGA液體培養(yǎng)基中，28 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，用AxyPrepTM Multisource Genomic DNA Miniprep kit （50-prep）提取基因組DNA。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度，并拍照記錄。通過超微量分光光度計測定OD值計算其濃度，并用無菌水將其稀釋至10 ng/μL，20 ℃保存?zhèn)溆?。本研究用已知的黃單胞菌DNA為模板，從17條細菌隨機擴增片段多態(tài)性（RAPD）通用引物中篩選出條帶清晰、重復性好的引物。Rep-PCR引物則使用ERIC、BOX、REP（表2）。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2.2 RAPD PCR反應體系Khoodoo等[8]研究的基礎(chǔ)上進行優(yōu)化。PCR總體積為25 μL，其中模板2 μL，10×Bst Buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 μmol/L） 0.5 μL，引物（20 μmol/L）1 μL，Mg2+（25 mmol/L） 2.5 μL，Taq 酶（2.5 U/ μl）0.25 μL，ddH2O 16.25 μL。PCR反應條件：預變性94 ℃，2 min；變性94 ℃，40 s；退火35 ℃，1 min；延伸72 ℃，100 s；循環(huán)45次；72 ℃，10 min；取7 μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖電泳，100 V電壓，電泳50 min，用凝膠成像系統(tǒng)（Tanon 4100）拍照觀察。

1.2.3 Rep-PCR Rep-PCR反應體系總體積為50 μl，包括 1× PCR buffer mix 25 μL、50 pmol/L primer 4 μL、100 ng/μL 基因組 DNA 2 μL、ddH2O 19 μL。利用3個?；押塑账嵋铩Ｏ?5 ℃變性7 min； 然后94 ℃變性1 min，退火溫度分別為ERIC52 ℃（REP 40 ℃、BOX 53 ℃），65 ℃下延伸8 min，35個循環(huán)。65 ℃下再延伸15 min，4 ℃保持。取7 μL PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖電泳，4 ℃低溫、10 v/cm低壓慢速2 h，于凝膠成像系統(tǒng)（Tanon 4100）拍照觀察。

1.2.4 帶型統(tǒng)計及遺傳變異評價 用AlphaI?mager 2200對凝膠成像系統(tǒng)所拍的照片進行處理后，統(tǒng)計擴增條帶，出現(xiàn)可辨認條帶記錄為“1”，條帶缺失記錄為“0”，二元數(shù)據(jù)中缺失標記為“2”，形成“0/1”電泳圖譜，制成EXCEL表格。按照聚類分析軟件NTSYS-PC V2.1的格式要求編輯好數(shù)據(jù)，分別根據(jù)RAPD和Rep-PCR的帶型統(tǒng)計結(jié)果，計算出菌株間的遺傳距離矩陣，采用Mantal檢測評價不同分子標記遺傳分析的相關(guān)性。計算出菌株間的地理矩陣，然后通過Mantal檢測與遺傳距離矩陣的相關(guān)性。利用NTSYS-PC V2.1中的SIMQUAL程序計算菌株間相似系數(shù)（similarity coefficient），SHAN程序和UPGMA方法進行聚類分析，Treeplot模塊建立聚類分析樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Xad病原菌DNA提取與引物篩選

經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNA呈現(xiàn)條帶單一，不彌散，OD260/OD280比值在1.7～1.9之間，說明所得的 DNA 純度較好。檢測出 DNA 濃度大多在100 ng/?L以下，濃度較低，但已達到試驗要求。從17條細菌隨機擴增片段多態(tài)性（RAPD）通用引物中，去除條帶彌散，重復性差的4條引物（RAPD-01，RAPD-02，RAPD-05，RAPD-49），篩選出13個條帶清晰、重復性好的引物。

2.2 Xad病原菌RAPD分析

利用篩選出的13個引物對93個Xad進行RAPD擴增，擴增出的DNA片段大小為500～ 2 000 bp，擴增條帶數(shù)在6～12條之間，得到131個RAPD位點全為多態(tài)性位點，多態(tài)性位點頻率為100%，所以本研究中Xad的多態(tài)性很高（表3，圖1）。

2.3 Xad病原菌Rep-PCR分析

在RAPD分析的基礎(chǔ)上，為了進一步確定93個Xad的親緣關(guān)系和遺傳變異特征，利用Rep-PCR的ERIC、BOX、REP三種引物進行檢測。擴增條帶數(shù)目分別為：ERIC1R 17條， ERIC2 20條， BOXA1R 14條，REP1R-I / REP2-I 14條，總計65條，多態(tài)性比率為100%（表3，圖1）。由此可見，根據(jù)菌株間圖譜的差異可以區(qū)分供試的不同致病變種。

2.4 Xad 菌株的聚類分析

首先利用NTsys-pc 2.1軟件，分別根據(jù)RAPD和Rep-PCR的帶型統(tǒng)計結(jié)果，計算出菌株間的遺傳距離矩陣，Mantal檢測結(jié)果顯示存在顯著性相關(guān)（r=0.549 9，p=0.002），表明2種分子標記類型在多態(tài)性位點檢測上都有一定的功效（圖2）。Mantal檢測結(jié)果顯示遺傳距離矩陣與地理距離矩陣不存在顯著相關(guān)性（r = –0.072 6，p = 0.117 5）（圖3）。

為了更全面地評估所有菌株的遺傳變異水平，本研究綜合RAPD和Rep-PCR兩種標記類型的分型結(jié)果，對紅掌細菌性疫病的93個菌株進行UPGMA聚類分析，并繪制成樹狀圖。結(jié)果顯示，遺傳相似性系數(shù)變化幅度較大，分布在0.519 1～ 0.984 7之間，在相似水平63%時，可將93個不同來源的菌株分為3個遺傳組（Ⅰ～Ⅲ），分別包括58、28、7個菌株（圖4）。其中，遺傳組II又可再分為IIA、IIB，分別包括19和9個菌株。

3 討論

遺傳標記在群體中表現(xiàn)的等位基因數(shù)量多、位點多態(tài)性高，得到的遺傳信息才較為可靠。RAPD和Rep-PCR是微生物遺傳多樣性研究中常用的分子標記類型，兩者都具有操作簡單快捷、擴增條帶豐富、不需要菌種特異性DNA探針等優(yōu)點。其中，Rep-PCR基于微生物基因組中的高保守區(qū)進行擴增，常用的有基因外重復回文因子 （Repetitive Extragenic Palindromic， REP）[13-14]，腸細菌基因間重復一致序列（Enterobacterial Repetitive Inter-genic Consensus，ERIC）[15]和BOX插入因子（BOX1A element）[16]等。開發(fā)的Rep-PCR引物擴增產(chǎn)物通常包括5～20條大小在100 bp～5 kb 之間的條帶，這類檢測技術(shù)在微生物的多樣性研究中已得到廣泛應用[[17-21]。本研究篩選出的13條RAPD引物和Rep-PCR引物分別擴增出131、65個多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率均為100%，表明該方法是一種快速而有效的檢測方法，能較好地反映出不同菌種間的遺傳多樣性。RAPD擴增基因組的隨機區(qū)段，Rep-PCR引物擴增散布的重復序列及其間隔區(qū)，Mantal檢測顯示兩類引物檢測的群體遺傳距離顯著相關(guān)，表明了分析結(jié)果的可靠性，將Rep-PCR和RAPD結(jié)合，可以更準確地評價分析病原菌的群體遺傳結(jié)構(gòu)。

本研究中使用引物及菌株數(shù)量均較前人研究更多，因此得到的結(jié)果更具有代表性。與付貝等[11]研究不同，本研究中REP-PCR使用的BOXA1R、REP1R-I/REP2-I引物擴增的Xad，電泳條帶多且清晰，可以較好地分辨菌株間的遺傳差異。分子檢測病原菌可以減少外界影響，更好地反映病原菌的遺傳特性。但是，紅掌品種以及外界環(huán)境的不同影響著病原菌對寄主的作用，不同Xad對不同寄主的致病性還不明晰。因此，分子檢測結(jié)合病理學鑒定對于不同地區(qū)來源的病原菌進行分析，將有助于揭開紅掌細菌性疫病的起源、進化和遺傳發(fā)育關(guān)系。

紅掌細菌性疫病在我國是一種輸入性病害，伴隨紅掌的引入和擴大栽培，該病害已經(jīng)廣泛傳播。從本研究對我國不同疫區(qū)菌株的遺傳分析結(jié)果看，不同個體間和組群間的遺傳分化程度都較高，表明雖然該病害在我國的發(fā)生不超過30年，但病原菌已經(jīng)有著高度的遺傳變異，即使是在同一地區(qū)，乃至同一個紅掌種植棚內(nèi)，都可能分布著不同遺傳類型的Xad，前人對浙江省、廣東省不同生產(chǎn)區(qū)菌株的遺傳評價也證實了這一點[10-11]，這可能源于多次輸入事件，伴隨不同環(huán)境條件、管理方式、品種抗性等選擇壓力下導致遺傳分化。UPGMA聚類結(jié)果看，有些地理來源相同或接近的遺傳相似性程度較高，如源于海南和廣東的36個Xad菌株聚為一簇，但一些地理來源較遠的菌株也表現(xiàn)出高度的同源性，對其遺傳距離和地理距離進行的Mantal檢測結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，種群間表現(xiàn)為離散型的點狀分布，遺傳結(jié)構(gòu)較弱，遺傳距離和地理距離沒有顯著相關(guān)，可能的原因是：雖然紅掌生產(chǎn)中屬于設(shè)施栽培、隔離種植，但其組培幼苗、半成品花、商品花等活體植物存在頻繁的大范圍調(diào)運，加快了病原種群間的交流。

過往的研究表明，在天南星科植物中，至少存在兩類Xad菌株：（1）源于紅掌所在的花燭屬植物，除了能夠侵染觀賞花燭外，還能危害綠蘿、萬年青、合果芋、龜背竹、白鶴芋等大多數(shù)天南星科觀賞植物；（2）源于花燭屬之外的其他天南星科植物，大多表現(xiàn)為?；郧秩綶5]。在基于AFLP、Rep-PCR等分子標記檢測研究中，兩類菌株在遺傳聚類是能被分開[9-10]。本研究因為樣本采集的原因，缺乏非花燭屬植物來源的Xad菌株，無法和這類遺傳類型進行比較。另外，本研究中不同組群菌株的致病力變異水平、及其致病性遺傳和分子病理學基礎(chǔ)，仍需進一步的研究。

綜合以上分析，本研究揭示了我國紅掌細菌性疫病菌存在廣泛的遺傳多樣性，并初步劃分了種群類型，為病害監(jiān)測、抗病育種提供了參考。

參考文獻

[1] 蔣桂芝， 郭春雷. 西雙版納紅掌細菌性葉疫病病原菌初步研究[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科技， 2003， 26（3）： 10-12.

[2] 劉瓊光， 梁建梅， 李志偉， 等. 紅掌細菌性葉枯病的病原鑒定[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學學報， 2007， 26（2）： 174-177.

[3] 蘇 婷， 龍那葩， 羅士波， 等. 浙江省紅掌細菌性疫病病原鑒定[J]. 浙江林業(yè)科技， 2008， 28（6）： 40-42.

[4] 張榮意， 譚志瓊， 劉愛榮， 等. 黃單胞菌引致紅掌疫病的癥狀和病原菌鑒定[J]. 熱帶作物學報， 2003， 24（2）： 81-85

[5] PM7/23（2）： Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae[J]. EPPO Bulletin. 2009， 39（3）： 393-402.

[6] Norman D J， Alvarez A. A rapid method for the presumptive identification of Xanthomonas campestris pv. dieffenbachiae and other Xanthomonas[J]. Plant Disease. 1989， 73（8）： 654- 658.