一例豬圓環(huán)病毒3型與豬圓環(huán)病毒2型混合感染的實(shí)驗(yàn)室診斷

楊克禮 焦祖武 田永祥 周丹娜 段正贏 郭銳

摘要：2016年美國報道了一種新型病毒豬圓環(huán)病毒3型（Porcine Circovirus 3，PCV3）。隨后，包括中國在內(nèi)的許多國家報道了該病的流行。2018年4月，湖北省襄陽市某豬場送樣品至本實(shí)驗(yàn)室檢測。本實(shí)驗(yàn)室利用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse Transcrlption Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）、一步法逆轉(zhuǎn)錄PCR（One Step Reverse Transcription PCR，One Step RT-PCR）及多重PCR方法分別檢測了豬瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PorcineReproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV）、PCV2及PCV3。結(jié)果CSFV、PRRSV均為陰性。PCV2、PCV3為陽性且存在混合感染現(xiàn)象。經(jīng)采取綜合防控措施后，本次疫情得到控制。

關(guān)鍵詞：豬圓環(huán)病毒3型;豬圓環(huán)病毒2型;混合感染;一步法逆轉(zhuǎn)錄PCR

中圖分類號：S855.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-0769（2018）10-0033-03

豬圓環(huán)病毒（Porcine Circovirus，PCV）在分類學(xué)上屬圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，是目前己知的最小的動物病毒之一^[1]。病毒粒子直徑14 nm～17 nm，呈20面體對稱結(jié)構(gòu)，無囊膜，含有共價閉合的單股環(huán)狀負(fù)鏈DNA，基因組大小約為1.7 kb。2016年以前，在全球范圍內(nèi)僅發(fā)現(xiàn)PCV有PCV1和PCV2兩個基因型^[2]。PCV1是豬腎細(xì)胞PK-15污染物，但不產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)，對豬無致病性。PCV2是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的主要病原，與豬皮炎與腎病綜合征、豬呼吸道疾病綜合征、繁殖障礙、增生性壞死性肺炎和腸炎等疫病密切相關(guān)。PCV2感染一般不會直接引起豬的死亡，主要是引起豬體的免疫抑制^[3-4]。

2015年，美國首次報道發(fā)現(xiàn)一種新型的豬圓環(huán)病毒——PCV3，隨后波蘭、韓國、意大利和中國等國家均報道有PCV3的發(fā)生與流行^[5]。2016年以來，我國華中、華東、華南地區(qū)的十余個省份陸續(xù)報道該病的流行。PCV3可引起豬的皮炎、腎病綜合征、繁殖障礙及心臟和多系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)，給全世界的生豬養(yǎng)殖造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失^[6]。

由于PCV2能破壞豬體的免疫系統(tǒng)，造成免疫抑制，因而本病常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PorcineReproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV）、豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies Virus，PRV）、豬肺炎支原體、多殺性巴氏桿菌和鏈球菌等混合或繼發(fā)感染^[7]。PCV3感染后，豬的臨床表現(xiàn)與PCV2引起的癥狀極其相像。與PCV2類似，PCV3在臨床上可單獨(dú)存在，也可與其他病原混合感染^[8-9]。

2018年4月份，湖北省襄陽市某豬場部分保育豬出現(xiàn)持續(xù)性、反復(fù)性腹瀉、發(fā)燒、氣喘等癥狀，病豬消瘦，四肢前端、后背、臀部皮膚發(fā)紺，后背兩側(cè)皮膚有散在紅色點(diǎn)狀丘疹。經(jīng)多種抗生素治療未見好轉(zhuǎn)。故于發(fā)病約10 d后送檢2頭發(fā)病瀕死豬至本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原檢測?，F(xiàn)將實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1病料

發(fā)病瀕臨死亡保育豬2頭，由湖北省襄陽市某豬場送至本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原檢測。

1.2檢測所用試劑（盒）

Viral DNA/RNA Miniprep Kit （AxygenScientific）、Ex-Taq酶、Prime Script One StepRT-PCR Kit、DL 2000 Marker（Takara）、膠回收試劑盒（TIANGEN）和其他生化試劑（為國產(chǎn)分析純，購自武漢某商業(yè)公司）。

1.3引物設(shè)計(jì)

豬瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV）、PRRSV分別參照文獻(xiàn)^[10-11]設(shè)計(jì)，PCV2、PCV3引物序列如下：

PCV2-F：5'-CACATCGAGAAAGCGAAAGGAAC-3'

PCV2-R：5'-TGCGGGCCAAAAAAGGTACAGTT-3'

PCV3-F：5'-AGTGCTCCCCATTGAACG-3'

PCV3-R：5'-CGACCAAATCCGGGTAAGC-3'

PCV2、PCV3預(yù)期產(chǎn)物大小分別為505 bp、1 007 bp，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.4病毒檢測

剖檢瀕死保育豬，取淋巴結(jié)、脾臟、肺臟、腎臟等組織，按1：5加入pH 7.2的磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate Buffer Saline，PBS）混合研磨，反復(fù)凍融3～5次，4℃12 000 r/min離心10 min～15 min;取上清液200 μL～400 μL用Viral DNA/RNA Miniprep Kit提取病毒核酸，根據(jù)病理剖檢特征及送檢要求，分別應(yīng)用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse Transcription Polymerase ChainReaction，RT-PCR）^[10]和一步法逆轉(zhuǎn)錄PCR（One StepReverse Transcription PCR， One Step RT-PCR）^[11]檢測CSFV、PRRSV，利用復(fù)合PCR方法檢測PCV2和PCV3。熒光定量RT-PCR和One Step RT-PCR方法的反應(yīng)體系及反應(yīng)程序分別按對應(yīng)文獻(xiàn)進(jìn)行;檢測PCV2和PCV3的復(fù)合PCR方法按如下反應(yīng)體系和循環(huán)參數(shù)進(jìn)行：

總體積為50 μL的反應(yīng)體系，包含10×PCRbuffer 5.0μL、10 mM dNTPs 4μL、10μM上下游引物各1μL、Ex-Taq（5 U/μL）0.5μL、模板DNA 5.0μL、dd H₂0補(bǔ)充至50μL。

循環(huán)參數(shù)95℃5 min，94℃40 s，56℃40 s，72℃1min，共35個循環(huán);72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測并在凝膠成像系統(tǒng)中觀察、拍照記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 CSFV檢測結(jié)果

參照文獻(xiàn)^[10]方法對2頭保育豬淋巴結(jié)、脾臟、肺臟、腎臟等組織RNA進(jìn)行熒光定量PCR檢測，結(jié)果僅陽性對照產(chǎn)生了特異性熒光，其他所有樣品及陰性對照均未見特異性熒光產(chǎn)生，即所有檢測樣品均為CSFV陰性（圖1）。

2.2 PRRSV檢測結(jié)果

參照文獻(xiàn)^[11]方法對2頭保育豬淋巴結(jié)、肺臟等組織RNA進(jìn)行One Step RT-PCR檢測，結(jié)果僅陽性對照產(chǎn)生了特異性目的條帶，其他所有樣品及陰性對照均無特異性目的條帶產(chǎn)生，即所有檢測樣品均為PRRSV陰性（圖2）。

2.3 PCV2、PCV3復(fù)合PCR檢測結(jié)果

利用1.4病毒檢測中的PCV2、PCV3檢測引物，按照上述反應(yīng)體系及循環(huán)參數(shù)進(jìn)行復(fù)合PCR檢測，結(jié)果8份樣品中，2份肺組織和1份淋巴結(jié)組織PCV2、PCV3陽性，1份淋巴結(jié)組織和1份脾組織PCV3陽性，2份腎組織PCV2陽性，1份脾組織陰性（圖3）。

綜合上述實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果，確診該病例為PCV3與PCV2的混合感染。

討論

本次實(shí)驗(yàn)室檢測根據(jù)送檢要求及臨床發(fā)病癥狀及病理剖檢特征，分別對CSFV、PRRSV、PCV3和PCV2進(jìn)行了檢測，結(jié)果該場發(fā)病保育豬CSFV和PRRSV均為陰性，但存在PCV3和PCV2均為陽性且為雙重感染病例。近年來，我國部分地區(qū)動物流行病學(xué)監(jiān)測結(jié)果顯示豬圓環(huán)病毒2型的感染率及其引起的豬圓環(huán)病毒病的暴發(fā)次數(shù)都有上升的趨勢，且常與PRRSV、PRV和CSFV等混合感染，表現(xiàn)出較高的病死率，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失^[12-14]。

自2016年美國首次在豬群中檢測出PCV3以來，在我國包括湖北省、廣東省、河北省及山東省等10多個省份均檢測出有PCV3的存在^[15-17]。隨著PCV3感染率和流行率的快速增長，引起了獸醫(yī)及相關(guān)科研人員的廣泛關(guān)注。臨床上PCV2主要侵害哺乳仔豬、保育豬、育肥豬和懷孕母豬，引起的特征性臨床癥狀為患豬體質(zhì)不良、皮膚蒼白，還可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征等多種表現(xiàn)各異的疫病^[18]。而PCV3初次發(fā)現(xiàn)時，感染PCV3的豬并沒有呈現(xiàn)特征性臨床特征，僅是利用組織切片觀察到部分組織出現(xiàn)了病理變化^[19]。但這些癥狀和病理變化并不一定是豬感染PCV3后引起的特征性病變，加上PCV3分離培養(yǎng)難度較大，因此PCV3的預(yù)防和控制更加不易。

由于PCV2和PCV3均無有效藥物進(jìn)行治療。因此，建議本病例采取綜合防控措施。具體如下：（1）完善豬場的生物安全體系建設(shè)，豬場徹底消毒。最大限度地降低豬場內(nèi)污染的病原微生物，杜絕豬群繼發(fā)感染。（2）分群飼養(yǎng)，切勿將不同日齡的豬混群飼養(yǎng)，降低豬群之間PCV2和PCV3的接觸感染機(jī)會。（3）提高豬群的營養(yǎng)水平。由于PCV2感染可以導(dǎo)致豬群的免疫功能下降，因此，提高豬群的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素和微量元素等水平，提高飼料的質(zhì)量，保證充足的飲水，可以降低PCV2的發(fā)病率。（4）加強(qiáng)管理，減少應(yīng)激。（5）做好免疫預(yù)防。切實(shí)做好豬瘟、豬繁殖與呼吸障礙綜合征、豬偽狂犬病等的免疫接種。也可以緊急接種豬圓環(huán)病毒滅活疫苗。（6）根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，選擇使用敏感藥物，控制細(xì)菌的繼發(fā)感染。通過約1周的實(shí)施后，豬場己無死亡病例發(fā)生，疫病得到控制。 由于PCV3的病原學(xué)特性、流行病學(xué)特點(diǎn)、致病機(jī)理尚不清楚，因此PCV2與PCV3混合感染病例中PCV3與PCV2如何引發(fā)機(jī)體致病的具體致病機(jī)理亦無法判斷。本次檢測結(jié)果表明，PCV3不僅在湖北省內(nèi)有流行，且存在與PCV2的混合感染的現(xiàn)象，PCV3和PCV2今后在湖北省內(nèi)的發(fā)展趨勢及其對養(yǎng)豬業(yè)的具體危害，有待于進(jìn)一步的研究。

（參考文獻(xiàn)：19篇，略）