雒明池 ，梁 如 ，高樹明，李 琳 ，高 杉

抑郁癥是一種極度危害人類身心健康的常見精神疾病，常伴有嚴(yán)重的并發(fā)癥，嚴(yán)重危害人們的健康[1]。世界衛(wèi)生組織（WHO）已將其列為十大嚴(yán)重疾病之一[2]。抑郁癥的高發(fā)病率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率迫切要求研究者加速對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究以及開發(fā)療效更好的抗抑郁藥物[3]。近年來(lái)多靶點(diǎn)作用機(jī)制逐漸成為抑郁癥研究的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)，研究者發(fā)現(xiàn)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)理論更適合闡明抗抑郁藥物的多靶點(diǎn)作用機(jī)制。目前，與抗抑郁藥物作用機(jī)制相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要涉及cAMP-PKA-CREBBDNF通路、NO-cGMP-PKG通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路、IP3/Ca2+DAG/PKC 通路等[4]。第二信使分子cAMP和cGMP成為了現(xiàn)代中醫(yī)藥研究者關(guān)注的熱點(diǎn)之一。美國(guó)生物學(xué)家Goldberg[5]于1975年提出了“陰陽(yáng)學(xué)說(shuō)與cAMP和cGMP雙向生物調(diào)節(jié)關(guān)系的假說(shuō)”，并推論cAMP與cGMP的雙向控制系統(tǒng)能統(tǒng)一許多不同生物調(diào)節(jié)現(xiàn)象的原理，即陰陽(yáng)學(xué)說(shuō)的基本原理所在，這個(gè)理論被國(guó)內(nèi)中醫(yī)學(xué)者認(rèn)同[6]。

中醫(yī)古方交泰丸，由黃連：肉桂配伍組成，黃連味苦性寒入心經(jīng)，可以清降心火以下交腎水；肉桂味辛性熱入腎經(jīng)，可以溫升腎水以上濟(jì)心火，兩藥一寒一熱，一陰一陽(yáng)，共奏交通心腎，調(diào)神定志之功，臨床上常用于治療失眠，更年期綜合癥[8-9]。但近代有研究表明交泰丸具有抗抑郁作用，如錢哲等[10]研究表明交泰丸能夠通過(guò)調(diào)節(jié)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的小鼠模型的單胺能反應(yīng)及抗炎作用來(lái)緩解治療小鼠的抑郁樣改變。西醫(yī)學(xué)研究也證實(shí)，黃連中所含的小檗堿具有抗抑郁作用[11-12]。肉桂所含的桂皮醛可以可用作改善抑郁癥和焦慮癥癥狀的輔助療法[13]。本研究將基于cAMP-CREB-BDNF信號(hào)通路探討交泰丸抗抑郁的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD大鼠，雄性，體質(zhì)量140～160 g。由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物合格證編號(hào)：SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與制備 黃連、肉桂飲片（均購(gòu)自安徽省亳州市藥材總公司中西藥公司）。陽(yáng)性對(duì)照藥物：鹽酸氟西?。ò賰?yōu)解），禮來(lái)蘇州制藥有限公司，批號(hào)：4482A。交泰丸制備工藝參考課題組前期研究[14]。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 萬(wàn)能粉碎機(jī)（浙江屹立工貿(mào)有限公司，QE-100克）、超低溫冰箱（中國(guó)Haier公司）；開場(chǎng)行為觀察箱、Digibehave雙畫面動(dòng)物行為視頻分析系統(tǒng)2．1版、水合氯醛、Mouse/Rat cAMP Parameter Assay Kit試劑盒（美國(guó)R&D公司）、10×PBS（上海生工生物工程股份有限公司）、蛋白酶抑制劑（德國(guó)羅氏試劑公司）、Human/Mouse/Rat Phospho-CREB(S133)DuoSet ICELISA試劑盒（美國(guó)R&D 公司）、Total BDNF Quantikine ELISA Kit試劑盒（美國(guó)R&D公司）、PDE-GloTM Phosphodiesterase Assay（美國(guó) Promega公司）、p-CREB抗體（英國(guó)Abcam公司）等。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組與給藥 將開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)行為比較接近的大鼠72只，隨機(jī)分為6組，分別為空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥對(duì)照組（鹽酸氟西汀，7．5 mg/kg）和交泰丸低（生藥 0．75 g/kg）、中（生藥 1．5 g/kg）、高（生藥3 g/kg）劑量組，每組12只，分籠飼養(yǎng)。大鼠抑郁模型的建立采用慢性溫和不可預(yù)知性應(yīng)激刺激（CUMS），具體操作參考課題組前期研究[14]，刺激主要包括禁食24 h；禁水24 h，夾尾持續(xù)2 min；晝夜顛倒；振蕩2 min；4℃冷水游泳5 min。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 大鼠海馬組織中 cAMP、p-CREB、BDNF、PDE含量以及大鼠血漿中cAMP的含量測(cè)定 嚴(yán)格按照cAMP試劑盒說(shuō)明書操作分別測(cè)定大鼠血漿及海馬組織中cAMP的濃度；按照p-CREB試劑盒、BDNF試劑盒、PDE活性試劑盒測(cè)定大鼠海馬組織中p-CREB、BDNF的含量及PDE的活性。

1.5.2 大鼠海馬、皮質(zhì)中BDNFmRNA表達(dá)含量測(cè)定 參考前期實(shí)驗(yàn)研究方法[15]，根據(jù)試劑盒說(shuō)明，采用Qiagen RNeasy Mini kit試劑盒分別提取大鼠海馬、皮質(zhì)中mRNA，測(cè)定mRNA濃度。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明冰上操作，合成cDNA于-80℃保存?zhèn)溆谩晒舛縋CR實(shí)驗(yàn)：應(yīng)用ABI?7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀分析軟件測(cè)定BDNFmRNA的表達(dá)。反應(yīng)以β-actin和GAPDH作為內(nèi)參，引物序列見表1。

1.5.3 大鼠海馬組織p-CREB陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)分析 取大鼠海馬組織石蠟包埋切片，將切片置于3%H2O2溶液中室溫10 min滅活內(nèi)源性酶，熱修復(fù)抗原，滴加一抗（兔抗大鼠 IgG，1∶100），4 ℃孵育 48 h，磷酸鹽緩沖溶液（PBS）清洗，滴加生物素化山羊抗兔IgG，37 ℃，20 min。采用 S-P（Streptavidin-perosidase）法染色及DAB顯色。在大鼠海馬CA1、CA3區(qū)，高倍鏡（×400）下隨機(jī)選取5個(gè)視野，拍照后用Image-Pro Plus6．0專業(yè)圖像分析軟件進(jìn)行定量分析，測(cè)定區(qū)域面積（Area）及積分光密度值（IOD）。計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的平均光密度（AOD），以此評(píng)價(jià)大鼠海馬組織中P-CREB陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)情況。AOD=IOD/Area×100%。

表1 RT-PCR引物序列及反應(yīng)參數(shù)Tab.1 RT-PCR primer sequenceand reaction parameters

1.6 統(tǒng)計(jì)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，使用SPSS19．0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。組間比較使用單因素方差分析（One-Way ANOVA）法，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 交泰丸對(duì)CUMS大鼠血漿和海馬組織中cAMP含量的影響 模型組大鼠血漿和海馬組織中cAMP含量均明顯降低，與空白對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．01）。陽(yáng)性藥對(duì)照組、交泰丸低、中、高劑量組均能夠不同程度地升高大鼠血漿中和海馬組織中cAMP的含量，與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05 或 P＜0．01）。見表 2。

表2 交泰丸對(duì)CUMS大鼠腦海馬組織和血漿中cAMP含量的影響（x±s）Tab.2 Effect of Jiaotaipill on the contents of cAMPin the hippocampusand plasma of CUMSrats（x±s）

2.2 交泰丸對(duì)CUMS大鼠海馬組織中p-CREB、BDNF含量以及PDE活性影響 模型組大鼠海馬組織中p-CREB、BDNF的含量明顯下降，與空白對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．01）。陽(yáng)性藥對(duì)照組、交泰丸低、中、高劑量組均能夠不同程度地升高大鼠海馬組織中p-CREB、BDNF的含量，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05 或 P＜0．01）。模型組大鼠海馬組織中PDE活性明顯升高，與空白對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．01）。陽(yáng)性藥對(duì)照組、交泰丸低、中、高劑量組均能夠不同程度地降低大鼠海馬組織中PDE的活性，其中陽(yáng)性藥對(duì)照組、交泰丸中、高劑量組與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05或P＜0．01）。見表 3。

表3 交泰丸對(duì)CUMS大鼠海馬組織中p-CREB、BDNF含量以及PDE活性的影響（x±s）Tab.3 Effect of Jiaotaipill on the contentsof p-CREB and BDNF and the activity of PDE in thehippocampusof CUMSrats（x±s）

圖1 交泰丸對(duì)CUMS大鼠海馬、皮質(zhì)中BDNF mRNA表達(dá)的影響Fig.1 Effect of Jiaotaipill on theexpression of BDNF mRNA in the hippocampusand cortex of CUMSrats

2.3 交泰丸對(duì)CUMS大鼠海馬、皮質(zhì)中BDNF mRNA表達(dá)的影響 以GAPDH作為內(nèi)參引物時(shí)，模型組大鼠海馬、皮質(zhì)中BDNFmRNA表達(dá)顯著降低，與空白對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．01）。陽(yáng)性藥對(duì)照組、交泰丸低、中、高劑量組均能夠不同程度地上調(diào)大鼠海馬、皮質(zhì)中BDNF mRNA的表達(dá)水平，與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05或P＜0．01）。以β-actin作為內(nèi)參引物時(shí)，模型組大鼠海馬、皮質(zhì)中BDNF mRNA表達(dá)顯著降低，與空白對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．01）。陽(yáng)性藥對(duì)照組、交泰丸低、中、高劑量組均能夠不同程度地上調(diào)海馬、皮質(zhì)中BDNFmRNA的表達(dá)水平，與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05 或 P＜0．01)。見圖 1。

2.4 交泰丸對(duì)CUMS大鼠海馬組織p-CREB陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)影響 在大鼠腦內(nèi)海馬組織CA1區(qū)中，模型組大鼠p-CREB陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)顯著降低，與空白對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0．01）。陽(yáng)性藥組、交泰丸低、中、高劑量組均能夠不同程度地上調(diào)海馬組織中p-CREB細(xì)胞的表達(dá)水平，與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05 或 P＜0．01）。在大鼠腦內(nèi)海馬組織CA3區(qū)中，模型組大鼠p-CREB陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)顯著降低，與空白對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．01）。陽(yáng)性藥組、交泰丸低、中、高劑量組均能夠不同程度地上調(diào)海馬組織中p-CREB細(xì)胞的表達(dá)水平，與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05 或 P＜0．01）。見圖2。

3 討論

圖2 交泰丸對(duì)CUMS大鼠腦內(nèi)海馬組織p-CREB陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)影響（×400）Fig.2 The effect of Jiaotaipill on the expression of p-CREB positive cellsin the hippocampusof CUMSrats(×400)

本研究中采用CUMS建立大鼠抑郁癥模型，此模型所展現(xiàn)出來(lái)的行動(dòng)減少，興趣缺乏以及快感缺失等抑郁狀態(tài)，被認(rèn)為與臨床診斷為抑郁癥的患者所展現(xiàn)出的精神運(yùn)動(dòng)改變、興趣和快感的喪失有著密切的關(guān)系[16]，是與臨床實(shí)際最為貼切、最具代表性的抑郁癥模型，有研究表明其相當(dāng)于現(xiàn)代生活中3周左右的社會(huì)生活壓力[17]。CUMS模型最早由Katz等提出，它被用于評(píng)估抗抑郁癥藥物的療效，臨床上幾乎所有對(duì)于抑郁癥有效的藥物均可以在不同程度上逆轉(zhuǎn)CUMS模型中抑郁樣改變，據(jù)此說(shuō)明該動(dòng)物模型具有較好的預(yù)測(cè)性，而本課題組前期的研究[14]也表明交泰丸能夠逆轉(zhuǎn)CUMS大鼠的抑郁樣改變。

目前cAMP-CREB-BDNF細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是研究最早、最為深入的抗抑郁藥物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，經(jīng)早期研究顯示自殺死亡的抑郁癥患者前額皮質(zhì)cAMP含量有所降低，重癥抑郁癥患者尸體解剖研究顯示其腦內(nèi)海馬CREB磷酸化水平均明顯下降[18]。cAMP-CREB-BDNF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被認(rèn)為是抑郁癥神經(jīng)元再生關(guān)鍵性環(huán)節(jié)之一，與大腦的空間記憶以及學(xué)習(xí)功能相關(guān)[19]。在抑郁治療過(guò)程中，CREB不僅能增強(qiáng)顆粒細(xì)胞神經(jīng)元的整合和功能的可塑性，且可直接調(diào)控BDNF的合成及轉(zhuǎn)錄，BDNF是調(diào)節(jié)神經(jīng)元活動(dòng)最重要基因之一[20]，參與軸突再生、樹突生長(zhǎng)和突觸可塑性的調(diào)節(jié)，促進(jìn)海馬神經(jīng)再生，從而發(fā)揮抗抑郁的作用。PDE作為抑制劑工具可通過(guò)上調(diào)cAMP-CREB-BDNF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而起到改善認(rèn)知功能、抗焦慮及抗抑郁的作用[21]。研究中通過(guò)檢測(cè)抑郁癥大鼠海馬組織及血漿中cAMP的含量變化和大鼠海馬中p-CREB、BDNF含量的變化，以及大鼠海馬組織中BDNFmRNA的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)交泰丸干預(yù)治療抑郁癥大鼠后，大鼠海馬組織及血漿中的cAMP和海馬組織中p-CREB、BDNF含量均明顯上升，進(jìn)一步研究顯示在大鼠海馬、皮質(zhì)中BDNF mRNA均出現(xiàn)高表達(dá)，同時(shí)降低了PDE活性明顯降低，逆轉(zhuǎn)了CUMS大鼠海馬組織CA1、CA3區(qū)的改變。綜上說(shuō)明交泰丸可通過(guò)調(diào)節(jié)cAMP-CREB-BDNF細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的表達(dá)來(lái)達(dá)到抗抑郁的目的。

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