澤瀉HPLC-UV指紋圖譜研究

張麗娜，張 兵，薛志峰，韓鵬軍，皮佳鑫，李 楠，祁東利*，劉志東*

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術(shù)教育部工程中心，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，天津 300193)

中藥澤瀉為澤瀉科植物澤瀉Alismaorientale(Sam) Juzep.的干燥塊莖，性寒，味甘、淡，歸腎、膀胱經(jīng)，具有利水滲濕、泄熱、化濁降脂等功效，常用于小便不利、水腫脹滿、泄瀉尿少、痰飲眩暈、熱淋澀痛和高血脂癥[1]。澤瀉的化學(xué)成分主要有三萜類化合物、倍半萜類化合物、二萜類化合物、多糖和其他成分[2-5]，其中三萜類化學(xué)成分均為原萜烷型四環(huán)三萜，主要包括澤瀉醇A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O及其同系物等，具有降血脂[6-9]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[10-12]和保肝[13]等藥理活性；澤瀉中倍半萜類化學(xué)成分主要是愈創(chuàng)木烷型(環(huán)氧澤瀉烯)、吉瑪烷型(半萜吉瑪烯C、吉瑪烯D)、桉葉型(桉烯二醇)和O-plopanane型等[14-16]，其中以環(huán)氧澤瀉烯為主的愈創(chuàng)木烷型化合物抑制核因子κB (NF-κB) 活性，抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)，抑制一氧化氮的產(chǎn)生，具有抗炎活性[17-20]，該類成分可能是澤瀉治療熱淋澀痛的主要物質(zhì)。澤瀉質(zhì)量分析多用HPLC指紋圖譜技術(shù)來研究不同批次澤瀉的質(zhì)量差異，大多數(shù)報(bào)道主要指認(rèn)原萜烷型三萜化合物。本文建立了澤瀉的HPLC-UV指紋圖譜法，對(duì)11批澤瀉進(jìn)行指紋圖譜研究，成分指認(rèn)兼顧原萜烷型三萜成分和倍半萜類成分，以期為全面評(píng)價(jià)澤瀉的質(zhì)量提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 安捷倫1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；XP205型十萬分之一天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；KQ-300B型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；Mill-QⅡ型超純水機(jī)(美國Millipore公司)；FW100型萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2試藥 環(huán)氧澤瀉烯對(duì)照品(購自中國食品藥品檢定研究院，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)；23-乙酰澤瀉醇B對(duì)照品(購自天津中新藥業(yè)有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)；甲醇、乙腈均為色譜純(購自Fisher Scientific公司)；澤瀉由正大青春寶藥業(yè)有限公司提供，按照《中國藥典》2015年版一部方法檢驗(yàn)，鑒定為澤瀉科植物澤瀉Alismaorientale(Sam) Juzep.塊莖的干燥飲片，產(chǎn)地和批號(hào)見表1。

表1澤瀉的編號(hào)、產(chǎn)地及批次信息

Tab.1 Producing places and batches ofRhizomaalismatis

編號(hào)產(chǎn)地批號(hào)編號(hào)產(chǎn)地批號(hào)S1四川14010S7江西14001S2四川14011S8江西14002S3四川14012S9江西14003S4福建14007S10浙江14004S5福建14008S11浙江14005S6福建14009

2 方法與結(jié)果

2.1供試品溶液的制備 取各批次澤瀉適量，粉碎，過60目篩，精密稱取2 g粉末，置于25 mL量瓶中，加乙腈超聲(400 W，40 kHz)30 min，放冷至室溫，定容，搖勻，過0.45 μm有機(jī)濾膜，續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱取環(huán)氧澤瀉烯對(duì)照品和23-乙酰澤瀉醇B對(duì)照品適量，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，配制成環(huán)氧澤瀉烯和23-乙酰澤瀉醇B質(zhì)量濃度均為0.2 mg·mL-1的對(duì)照品溶液，過0.45 μm有機(jī)濾膜，續(xù)濾液作為對(duì)照品溶液。

2.3色譜條件 色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動(dòng)相：乙腈(B)-水(A)，梯度洗脫(0～5 min，35%B；5～10 min，35%B～55%B；10～15 min，55%B～70%B；15～20 min，70%B～75%B；20～40 min，75%B)。流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1專屬性考察 取2.1項(xiàng)下制備的供試品溶液(批號(hào)14010)、2.2項(xiàng)下制備的23-乙酰澤瀉醇B對(duì)照品溶液和環(huán)氧澤瀉烯對(duì)照品溶液以及空白乙腈各10 μL，注入高效液相色譜儀，按照2.3項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣3次，記錄色譜圖，見圖1。

2.4.2精密度考察 取2.1項(xiàng)下制備的供試品溶液(批號(hào)14010)，精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀，按照2.3項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，結(jié)果表明，10個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值在0.01%～0.25%，相對(duì)峰面積的RSD值在0.89%～5.55%，結(jié)果表明，儀器精密度良好。

圖1HPLC圖

a.空白乙腈；b.23-乙酰澤瀉醇B對(duì)照品；c.環(huán)氧澤瀉烯對(duì)照品；d.樣品。

Fig.1 HPLC chromatograms

a.blank acetonitrile；b.23-acetate alisol B reference substance；c.alismoxide reference substance；d.sample.

2.4.3重復(fù)性考察 取同一批樣品(批號(hào)14010)，按照2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，分別精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀，按照2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果表明，10個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均小于0.25%，相對(duì)峰面積的RSD值在1.34%～4.62%，結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.4.4穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液(批號(hào)14010)，分別在0，4，8，12，24和48 h進(jìn)樣6次，按照2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，注入高效液相色譜儀，進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，10個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值在0.01%～0.34%，相對(duì)峰面積的RSD值在0.43%～7.76 %，結(jié)果表明，供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.5指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

2.5.1指紋圖譜的建立 取11批澤瀉，按照2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀，按照2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，所得澤瀉指紋圖譜共有10個(gè)共有峰，其中峰1和10分別是環(huán)氧澤瀉烯和23-乙酰澤瀉醇B，色譜圖見圖2。計(jì)算11個(gè)批次10個(gè)峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值在0.011 2%～0.231 7%，相對(duì)峰面積RSD值在8.5%～86.7%。

2.5.2相似度評(píng)價(jià) 用國家藥典委員會(huì)提供的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2012.130723版)對(duì)11批澤瀉樣品高效液相的分析結(jié)果進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，3號(hào)峰峰面積最大且穩(wěn)定，故選擇3號(hào)峰作為參比峰(S)，四川澤瀉14010(S1)作為參照，利用中位數(shù)法，時(shí)間窗設(shè)為1 min，進(jìn)行多點(diǎn)校正，Mark峰匹配，生成對(duì)照指紋圖譜R，以對(duì)照指紋圖譜R作為參照?qǐng)D譜，11批澤瀉指紋圖譜與之進(jìn)行相似度比較和評(píng)價(jià)，S1～S11澤瀉樣品相似度結(jié)果分別是0.997，0.972，0.991，0.941，0.994，0.860，0.995，0.967，0.950，0.952和0.969，各批次澤瀉相似度較高。指紋圖譜見圖3。

圖2澤瀉指紋圖譜

1.環(huán)氧澤瀉烯；2.23-乙酰澤瀉醇B。

Fig.2 Fingerprint chromatogram ofRhizomaalismatis

1.alismoxide；2.23-acetate alisol B.

圖3澤瀉的指紋圖譜疊加圖和對(duì)照指紋圖譜R

Fig.3 Fingerprint ofRhizomaalismatisand reference fingerprintR

3 討論

3.1檢測(cè)波長(zhǎng) 優(yōu)化本研究在澤瀉飲片指紋圖譜中指認(rèn)原萜烷類化合物23-乙酰澤瀉醇B和倍半萜類化合物環(huán)氧澤瀉烯，從兩類具有活性化合物的分析角度出發(fā)，進(jìn)行澤瀉指紋圖譜研究，可相對(duì)全面地評(píng)價(jià)澤瀉的質(zhì)量差異。3D全波長(zhǎng)(208～400 nm)掃描結(jié)果見圖4，這兩類化合物均為末端吸收，故選擇210 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2環(huán)氧澤瀉烯的指認(rèn) 本研究采用HPLC-UV法進(jìn)行澤瀉的指紋圖譜研究，首次使用愈創(chuàng)木烷型化合物環(huán)氧澤瀉烯對(duì)照品對(duì)澤瀉指紋圖譜色譜峰進(jìn)行指認(rèn)，實(shí)驗(yàn)方法學(xué)考察結(jié)果表明，此方法重復(fù)性好、精密度和穩(wěn)定性高，適用于澤瀉飲片的質(zhì)量評(píng)價(jià)研究。研究結(jié)果顯示，11批澤瀉藥材中環(huán)氧澤瀉烯峰面積波動(dòng)較小，無明顯差異，說明環(huán)氧澤瀉烯對(duì)不同產(chǎn)地澤瀉指紋相似度影響較小。

圖43D掃描圖譜

Fig.4 3D HPLC chromatograms of scanning atlas

3.323-乙酰澤瀉醇B的指認(rèn) 文獻(xiàn)報(bào)道，23-乙酰澤瀉醇B在新鮮植物中含量很高，是植物體內(nèi)存在的主要形式，而23-乙酰澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇G和23-乙酰澤瀉醇E等化合物在鮮品中沒有或含量很低[21]。從生物途徑角度來看，這些化合物均是23-乙酰澤瀉醇B的次級(jí)代謝產(chǎn)物[3，5]。不同產(chǎn)地[22-23]、采收期[24-25]和炮制加工方法[22，26-27]對(duì)植物體內(nèi)代謝酶的水平和活性有影響，從而影響23-乙酰澤瀉醇B向澤瀉醇A、澤瀉醇A單乙酸酯和澤瀉醇C等化合物的代謝轉(zhuǎn)化過程[6]，造成原萜烷型四環(huán)三萜類化合物的含量和指紋差異。實(shí)驗(yàn)觀察到了這種指紋差異，S6(福建)藥材的相似度為0.860，低于其他產(chǎn)地藥材的相似度。由圖3可知，S6藥材中8和10號(hào)峰明顯大于其他藥材對(duì)應(yīng)峰，而10號(hào)峰被指認(rèn)為23-乙酰澤瀉醇B，說明不同產(chǎn)地藥材中23-乙酰澤瀉醇B的生物合成水平與代謝轉(zhuǎn)化過程存在差異。

23-乙酰澤瀉醇B及其次級(jí)代謝產(chǎn)物在降血脂活性方面有顯著差異，其中24-乙酰澤瀉醇A降膽固醇作用最強(qiáng)，23-乙酰澤瀉醇C、澤瀉醇A和23-乙酰澤瀉醇B次之，澤瀉醇B未見抑制血脂升高作用[28]。結(jié)果表明，23-乙酰澤瀉醇B的代謝轉(zhuǎn)換過程研究對(duì)澤瀉質(zhì)量控制具有重要意義。本文根據(jù)澤瀉藥材的藥理作用和相關(guān)活性成分，建立了基于愈創(chuàng)木烷型倍半萜成分和原萜烷型四環(huán)三萜類化合物為指認(rèn)成分的指紋圖譜研究，發(fā)現(xiàn)了部分產(chǎn)地澤瀉的相似度較低，指出了23-乙酰澤瀉醇B的代謝轉(zhuǎn)化差異是造成藥材指紋圖譜相似度低的原因之一，為全面評(píng)價(jià)澤瀉藥材的質(zhì)量奠定了理論基礎(chǔ)。23-乙酰澤瀉醇B代謝轉(zhuǎn)換過程的差異引起澤瀉藥材的藥理作用變化和質(zhì)量?jī)?yōu)劣有待進(jìn)一步研究。

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