HILIC-HPLC雙波長法測定山藥中尿囊素和腺苷的含量

朱群英，張亞鋒，蘇超男，謝錦艷

(1.陜西省藥品技術(shù)審核查驗中心，西安 710065；2.西安市食品藥品檢驗所，西安 710054；3.煙臺大學(xué)，煙臺 264005)

山藥是健脾補氣的良藥，是傳統(tǒng)的保健食品，臨床上常與胃腸飲同用治療脾胃虛弱、食少體倦和泄瀉等癥。山藥中含有鎂、鈉、鉀等多種對人體有益的微量元素，淀粉、蛋白質(zhì)和游離氨基酸等營養(yǎng)成分以及多糖(包括黏液質(zhì)及糖蛋白)、尿囊素、山藥素和腺苷等[1-7]。其中尿囊素不僅有滋潤皮膚的作用，還具有局麻和促進皮膚傷口愈合的功能[8-10]；腺苷具有舒張血管、抗心律失常和保護心肌的作用。

尿囊素和腺苷極性很大，在反相色譜柱上保留時間很短，易與極性化合物同時洗脫出色譜柱，導(dǎo)致分離效果不佳[11-12]。親水性高效液相色譜采用強極性固定相，結(jié)合高比例有機相和低比例水相組成的流動相對高極性化合物實現(xiàn)有效分離，對于強極性化合物具有很好的保留和高分離選擇性，對中藥復(fù)雜組分中強極性化合物的分析有較大優(yōu)勢[13-19]。本文采用親水性高效液相色譜對尿囊素和腺苷實現(xiàn)同時分離與測定，建立山藥中尿囊素和腺苷的質(zhì)量分析方法，該方法簡單、靈敏、準(zhǔn)確。本方法可為含山藥藥材、飲片及其制劑質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1260型液相色譜儀配置二極管陣列檢測器(美國Agilent公司)；KQ-300VDB雙頻數(shù)控型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；ME204E萬分之一電子天平、MS105十萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)。

1.2試藥 尿囊素對照品(批號1501-200001)、腺苷對照品(批號110879-200202)，均購自中國食品藥品檢定研究院。10批山藥飲片均購自本市藥店，經(jīng)西安市食品藥品檢驗所謝志民主任中藥師鑒定為山藥Rhizomadioscoreae，質(zhì)量符合《中國藥典》2015年版一部要求。甲醇、乙腈為色譜純(美國Fisher公司)；水為純凈水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱為Waters XBridge Amide (250 mm×4.6 mm，3.5 μm)；流動相：乙腈-水(90∶10)；流速：0.5 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；雙波長檢測：224和260 nm；理論塔板數(shù)按照尿囊素峰計算不低于7 000，各色譜峰之間的分離度大于1.5。色譜圖見圖1。

圖1HPLC圖

A.對照品(224 nm)；B.對照品(260 nm)；C.樣品(224 nm)；D.樣品(260 nm)；1.腺苷；2.尿囊素。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference substance (224 nm)；B.reference substance (260 nm)；C.sample (224 nm)； D.sample (260 nm)；1.adenosine；2.allantoin.

2.2對照品溶液的制備 分別精密稱取干燥至恒質(zhì)量的尿囊素對照品和腺苷對照品10和6 mg，置于25 mL量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為90%的乙腈溶解，定容，分別制得含尿囊素和腺苷質(zhì)量濃度為0.4和 0.24 mg·mL-1的對照品儲備溶液。分別精密量取尿囊素儲備溶液和腺苷儲備溶液20和5 mL，混勻，制備尿囊素和腺苷的質(zhì)量濃度分別為320和48 μg·mL-1的混合對照品溶液。不同質(zhì)量濃度的對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液由體積分?jǐn)?shù)為90%的乙腈按倍數(shù)逐級稀釋得到。

2.3供試品溶液的制備 取山藥飲片粉末0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入體積分?jǐn)?shù)為90%的乙腈10 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，冷卻至室溫，加入體積分?jǐn)?shù)為90%的乙腈補足減失的質(zhì)量，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4線性關(guān)系考察 精密量取2.2項下制備的2種對照品儲備液適量，用體積分?jǐn)?shù)為90%的乙腈分別稀釋成不同質(zhì)量濃度的對照品溶液。按照2.1項下色譜條件依次進樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

尿囊素的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=4.760 2x+44.629，r=0.999 3，質(zhì)量濃度在20.12～319.36 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

腺苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=69.181x+130.05，r=0.999 4，質(zhì)量濃度在3.09～49.12 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5精密度實驗 取標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液，其中尿囊素和腺苷的質(zhì)量濃度分別為67.07和10.31 μg·mL-1，按照2.1項下色譜條件連續(xù)進樣6次，測定尿囊素和腺苷的峰面積和保留時間，分別計算其RSD值，結(jié)果尿囊素峰面積和保留時間的RSD值分別為0.88%和0.15%，腺苷的峰面積和保留時間的RSD值分別為1.09%和0.15%，結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.6穩(wěn)定性實驗 取4號樣品的供試品溶液，分別在0，2，4，8，12，16和24 h進樣，按照2.1項下色譜條件進樣，測定尿囊素和腺苷的峰面積，結(jié)果二者色譜峰面積的RSD值分別為1.08%和0.99%，結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7重復(fù)性實驗 取4號樣品，按照2.3項下方法制備供試品溶液，平行6份，按照2.1項下色譜條件測定尿囊素和腺苷的峰面積，計算尿囊素和腺苷含量的RSD值分別為2.35%和2.56%，結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.8加樣回收率 實驗取4號樣品粉末0.5 g，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加入對照品溶液適量，按照2.3項下方法制備供試品溶液，平行6份，進樣分析，計算尿囊素和腺苷的加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率測定結(jié)果

2.9樣品的測定 取10個不同產(chǎn)地山藥飲片按照2.3項下方法制備供試品溶液，測定尿囊素和腺苷的峰面積，根據(jù)回歸方程計算各樣品中尿囊素和腺苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表2。

表2樣品中尿囊素和腺苷的含量

Tab.2 The contents of allantoin and adenosine in samples

樣品尿囊素含量/mg·g-1腺苷含量/mg·g-112．00．94024．20．12032．10．09046．20．22051．70．08561．20．07771．40．08583．00．08192．20．066103．50．130

3 討論

3.1檢測波長的確定 尿囊素和腺苷分別在224和 260 nm波長處有最大吸收，尿囊素在260 nm處不出峰，腺苷在224 nm處響應(yīng)較小，為了提高檢測的靈敏度，采用雙波長通道進行測定[20-21]。最終將尿囊素和腺苷的波長分別設(shè)定為224和260 nm。

3.2樣品提取方法的選擇 分別考察不同濃度的甲醇和乙腈作為提取溶劑，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)不同時間，考察對提取效率的影響。結(jié)果表明，以體積分?jǐn)?shù)為90%的乙腈作為提取溶劑，超聲處理30 min為最佳提取方案。

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