森林撫育間伐對靈芝活性成分的影響

張江萍,尹衛(wèi)東,劉和*

(1.山西林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,山西 太原 030003;2.山西省林業(yè)廳,山西 太原 030012)

0 引言

森林是陸地上最重要的碳儲(chǔ)存庫,儲(chǔ)存著全球陸地地上植被碳庫及地下土壤碳庫80%以上的碳資源[1]。森林資源的合理利用對于促進(jìn)經(jīng)濟(jì)增長,開發(fā)新資源有著舉足輕重的重要作用[2-3]。隨著林業(yè)資源需求量的增加,森林資源逐年減少,合理地保護(hù)森林資源已迫在眉睫[4]。透光撫育是合理利用和保護(hù)森林資源的一種重要方法。通過撫育調(diào)整群落結(jié)構(gòu)和林分密度,改善林木生長和生態(tài)環(huán)境,不僅可以達(dá)到合理保留樹種,促進(jìn)林下經(jīng)濟(jì)作物生長,而且能夠保障群落結(jié)構(gòu)的合理性,使其形成良好的層次結(jié)構(gòu)和各種林分結(jié)構(gòu),提高物種的豐富度和增強(qiáng)林下栽培資源的合理利用[5-7]。

靈芝(Ganodermalucidum)是傳統(tǒng)的扶正固本,滋補(bǔ)強(qiáng)壯的珍貴藥材,具有“安神,保神”,“人心生血,助心充脈”,“益肺氣,益肝氣,益脾氣”等功效[8-9]。在我國,靈芝作為藥用已有兩千多年的歷史[10]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,靈芝在免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)[11]、抗腫瘤[12]、抗病毒、清除體內(nèi)自由基[13-14]、降血脂等方面具有極其重要的作用[15]。目前,已經(jīng)從靈芝子實(shí)體中分離到400多種活性成分,其中包括糖類(多糖和低聚糖)、三萜類、核苷類、甾醇類、多肽、生物堿、呋喃衍生物、脂肪酸、揮發(fā)油、微量元素等[16-18]。其中多糖、三萜、甾醇等是最主要的活性成分,也是目前靈芝次生代謝產(chǎn)物研究的熱點(diǎn)[19]。

隨著靈芝栽培產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展,傳統(tǒng)的靈芝栽培模式因不注重產(chǎn)品品質(zhì)、產(chǎn)品結(jié)構(gòu)單一、有效成分含量低等缺點(diǎn)而逐漸在市場中失去競爭力。開發(fā)新的靈芝栽培模式,尋找與野生靈芝品質(zhì)相同的靈芝單品,提高靈芝藥效成分含量是近幾年人們關(guān)注的重點(diǎn)[20]。本研究通過不用撫育方式形成3種不同的撫育樣地(即強(qiáng)度透光H-L、中度透光M-L和弱度透光L-L),在各樣地內(nèi)擺放靈芝菌袋并進(jìn)行常規(guī)出菇管理,采收成熟靈芝后測定靈芝子實(shí)體主要活性成分的含量變化。以期開發(fā)新的栽培模式,提高藥效含量為靈芝產(chǎn)品的深度開發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐和林下真菌的栽培管理提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

靈芝由山西林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院食用菌項(xiàng)目組提供,保藏于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食用菌中心。

1.2 樣地概況

研究樣地設(shè)置為山西關(guān)帝山林局森林生態(tài)實(shí)驗(yàn)站。該地區(qū)地處呂梁山脈中段,地理位置為N37°54′26″ N,E111°31′36″E,海拔283 m,屬溫帶大陸性季風(fēng)氣候,具有水熱同季、濕潤多雨等特點(diǎn),夏季均溫27.6℃,年均降水量822.6 mm。樣地位于實(shí)驗(yàn)站海拔1 600 m處,以闊葉楊樺林為主。

1.3 樣地設(shè)置與靈芝栽培管理

本研究于4月中旬(生長季前)按照采伐闊葉樹的程度(分強(qiáng)、中、弱度)共設(shè)置9塊10 m×15 m標(biāo)準(zhǔn)地(各3次重復(fù)),不同標(biāo)準(zhǔn)地間距約20 m左右;強(qiáng)度撫育樣地(H-L)通過伐除喬木層喬木側(cè)枝和下方所有樹種,形成直徑約10 m的直射透光樣地;中度透光撫育樣地(M-L)通過伐除上方未達(dá)到林冠層的部分亞喬木及灌木,形成直徑約10 m的半透光樣地;弱度撫育樣地(L-L) 未進(jìn)行任何伐除的直徑10 m的弱度透光樣地。利用網(wǎng)格法在每塊標(biāo)準(zhǔn)地設(shè)置6個(gè)5 m×5 m的小樣方,對每個(gè)小樣方進(jìn)行編號(hào),于5月上旬在每個(gè)小樣方內(nèi)擺放50個(gè)進(jìn)入出菇管理期的靈芝菌袋(菌袋原料以木屑為主,規(guī)格為18 cm×40 cm×3 cm),并覆土栽培,按照常規(guī)出菇管理方式管理出菇,于10月份收集所有成熟的靈芝子實(shí)體,去除靈芝子實(shí)體表面的靈芝孢子粉,低溫冷凍干燥后,粉碎過80目篩。

1.4 靈芝有效成分含量的測定

1.4.1 靈芝子實(shí)體蛋白質(zhì)含量測定

用Folin-酚蛋白定量試劑盒(Solarbio)測定蛋白質(zhì)含量。制作牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算蛋白含量。

1.4.2 靈芝子實(shí)體多糖含量測定

采用硫酸蒽酮法測定多糖含量,參照郭曉蕾等[21]并略有改進(jìn)。取2 g干粉加入 90 mL水加熱回流提取2 h,提取液抽濾后定容至100 mL,取10 mL加入150 mL無水乙醇,4℃放置12 h沉淀多糖,離心,棄上清,沉淀加水溶解定容至50 mL,取2 mL樣品加入6 mL硫酸蒽酮溶液,水浴加熱15 min,625 nm處測定吸光度值。

1.4.3 靈芝子實(shí)體總?cè)苹衔锖繙y定

稱取1 g樣品,加入20 mL 70%(V/V)的乙醇溶液進(jìn)行超聲處理(超聲溫度40℃;超聲功率250 W;時(shí)間30 min),定容至50 mL,搖勻,過濾。吸取1 mL濾液于試管中,以70%的乙醇為參照,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線法在560 nm處測定吸光度值,以公式1計(jì)算樣品的總?cè)坪?以熊果酸計(jì))[22]。

(1)

式中:m為樣品質(zhì)量mg,v為吸取的濾液mL,Y為靈芝三萜的含量μg。

1.4.4 靈芝子實(shí)體麥角甾醇含量測定

參照邢增濤等[23]的方法,采用HPLC方法測定子實(shí)體中麥角甾醇含量。

1.4.5 子實(shí)體礦物質(zhì)元素測定

準(zhǔn)確稱取靈芝樣品2 g于石英坩堝中,用小火加熱至樣品不冒煙,然后大火燒至樣品成灰白色,轉(zhuǎn)移至550℃馬福爐,灰化6 h至灰化完全為止。收集樣品于試管中加入5 mL HNO3,加熱溶解殘?jiān)?待溶液蒸至約1 mL時(shí),轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,用去離子水定容,搖勻,采用原子吸收分光光度計(jì)測定含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用EXCEL2013和SPSS 17軟件對不同透光條件各樣地的透光孔隙度、靈芝子實(shí)體中有效成分含量進(jìn)行方差分析(ANOVA),數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,顯著性差異采用 Duncan多重比較法進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同撫育條件下林分孔隙度的差異

不同撫育條件下,林分孔隙度差異較為明顯(圖1)。每年4-6月份,林冠層闊葉樹葉片尚未完全展開,各樣地林分孔隙度均最大;6-8月份,林冠層闊葉樹枝葉量增加且葉片完全展開,強(qiáng)光撫育和中度撫育孔隙度的差異顯著較小,弱光撫育減少不顯著;8-10月份,林分孔隙度隨著闊葉樹枝葉量的增加開始減小,而后部分枝葉成熟,孔隙度增加。

Fig.1 Canopy openness of each plot in different tends of woods圖1 不同撫育條件下林分透光孔隙度

2.2 不同撫育條件下靈芝子實(shí)體中蛋白含量變化

不同撫育條件下靈芝子實(shí)體中蛋白質(zhì)含量不同(圖2)。M-L和H-L條件下顯著高于L-L(P<0.05),M-L和H-L條件下差異顯著。M-L條件下,子實(shí)體中蛋白質(zhì)含量最高,達(dá)到19.71 mg·g-1,其中M-L條件比L-L蛋白質(zhì)含量高42.9%,相對H-L條件僅高5.3%。強(qiáng)光和弱光都不利于蛋白質(zhì)的積累,可能是由于強(qiáng)光條件下代謝旺盛,導(dǎo)致蛋白質(zhì)消耗增加,弱光條件下子實(shí)體合成蛋白質(zhì)較少所致。

Fig.2 Protein contents in G. lucidum(mg·g-1)圖2 靈芝子實(shí)體蛋白質(zhì)含量(mg·g-1)

2.3 不同撫育條件下靈芝子實(shí)體中多糖含量變化

由圖3可知,不同條件下靈芝子實(shí)體中有效成分多糖含量不同。在M-L條件下,多糖含量顯著高于H-L和L-L(P<0.05),H-L顯著高于L-L(P<0.05)。M-L條件下多糖含量為1.88%,較H-L和L-L分別高11.2%和27.9%。強(qiáng)光和弱光都影響子實(shí)體多糖的合成。

Fig.3 Changes of polysaccharide in different tends of woods圖3 不同撫育條件下多糖含量變化

2.4 不同撫育條件下靈芝子實(shí)體中三萜含量變化

由圖4可知,不同撫育條件下靈芝子實(shí)體中三萜含量變化不同。M-L條件下,三萜含量為8.53%顯著高于H-L和L-L(P<0.05),較H-L和L-L分別高1.2%和20.5%。H-L顯著高于L-L(P<0.05)。光照影響三萜合成通路的代謝,進(jìn)而影響三萜含量,強(qiáng)光照條件子實(shí)體啟動(dòng)自身抵御光照的應(yīng)激反應(yīng),造成三萜合成降低。

Fig.4 Change of triterpenoids contents in different tends of woods圖4 不同撫育條件下三萜含量變化

2.5 不同撫育條件下靈芝子實(shí)體中麥角甾醇含量變化

圖5給出了靈芝子實(shí)體中麥角甾醇測定的HPLC圖，由圖6可知，不同撫育條件對子實(shí)體中麥角甾醇含量影響較大。三種撫育條件下麥角甾醇含量差異顯著(P<0.05),L-L條件下,麥角甾醇含量極顯著高于M-L和H-L,M-L和H-L之間也存在極顯著差異(P<0.05)。L-L條件下麥角甾醇含量為0.75 mg·g-1,較M-L和H-L高出102.7%和141.9%。弱光條件下,細(xì)胞膜的流動(dòng)性較差,細(xì)胞質(zhì)間信號(hào)分子之間的傳遞減慢,造成細(xì)胞膜中麥角甾醇含量增加。

A. Comparison products,B. G.lucidum,1. ergosterolFig.5 HPLC patterns of ergosterol in G.lucidum圖5 靈芝子實(shí)體中麥角甾醇測定HPLC圖

Fig.6 Ergosterol contents in G.lucidum(mg·g-1)圖6 靈芝子實(shí)體麥角甾醇含量(mg·g-1)

2.6 不同撫育條件下靈芝子實(shí)體中礦物質(zhì)元素變化

由表1可知,不同撫育條件下靈芝子實(shí)體中礦物質(zhì)元素含量有所變化,變化幅度不同。分析的12種元素中,H-L條件下4種元素含量較高,M-L條件下5種元素含量較高。其中大量元素K、Ca、Na在不同撫育之間存在顯著差異(P<0.05),K和Na元素含量變化較大。L-L條件下Na含量最高,H-L條件下K含量最高。微量元素中Cu、Fe、Sr、Zn在不同撫育條件下都存在極顯著差異,H-L條件下,Fe、Sr含量較高;M-L條件下僅Cu元素含量較高;L-L條件下Pb、Zn、Cd這三種微量元素含量較高。光照強(qiáng)度的不同靈芝子實(shí)體對元素的吸收不同,光照可能促進(jìn)了K、Fe、Sr、As等元素的吸收。

表1 不同撫育條件下礦物質(zhì)元素含量變化Table 1 Change of mineral elements in different tends of woods

3 討論

光是天然林更新中最重要的因素。光照對林下群落形態(tài)、植被的生長、森林環(huán)境的異質(zhì)性等有重要的影響[24]。透光撫育是促進(jìn)林業(yè)更替,保持持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵之舉,同時(shí)也是減少病蟲害和防止森林火災(zāi)的重要手段[25]。林下作物的有效價(jià)值是檢測撫育質(zhì)量的重要指標(biāo),靈芝作為代表性的藥用真菌,在本實(shí)驗(yàn)中作為檢測森林透光撫育質(zhì)量的最佳材料。靈芝生長對光照極為敏感,自然條件下靈芝子實(shí)體中有效成分與光照有直接關(guān)系,合理的透光撫育對于野生靈芝的栽培和生長具有重要的作用。

從4月到10月不同月份中透光孔隙度不同,導(dǎo)致了林內(nèi)光環(huán)境的時(shí)空異質(zhì)性。本實(shí)驗(yàn)測定了不同撫育條件下靈芝有效成分的變化。其中M-L條件下靈芝多糖、三萜化合物和甾醇這三種有效成分的含量均最高,說明光照對靈芝子實(shí)體這三種成分的影響較大。靈芝蛋白質(zhì)是除了靈芝多糖和三萜外,另一類重要的活性物質(zhì)。靈芝蛋白具有獨(dú)特的免疫原性,在免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤病等方面效果顯著[26]。通過林下栽培的靈芝子實(shí)體中蛋白質(zhì)含量高達(dá)19.52 mg·g-1,王紅梅等[27]對不同栽培品種的靈芝蛋白質(zhì)進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)蛋白含量最高14.09 mg·g-1,林下栽培的靈芝子實(shí)體中蛋白含量較人工栽培的最高菌株高5.43 mg·g-1。麥角甾醇是重要的生產(chǎn)黃體酮、氫化可的松、VD2等的前體物質(zhì),存在于絕大多數(shù)真菌細(xì)胞膜中,據(jù)研究麥角甾醇含量與真菌生物量存在相關(guān)關(guān)系,是真菌生物量的重要標(biāo)志[28]。麥角甾醇作為靈芝子實(shí)體中主要的甾醇類成分對于研究靈芝中小分子酸性成分有著重要的研究意義[29]。據(jù)測定靈芝子實(shí)體中麥角甾醇含量與其他物質(zhì)相比含量較少,但與其他食藥用菌相比,靈芝中麥角甾醇含量高很多。本研究中,隨著撫育程度的增加,靈芝子實(shí)體中麥角甾醇含量呈下降趨勢,弱度撫育條件下,麥角甾醇含量達(dá)到0.75 mg·g-1,較中度和強(qiáng)度撫育增加了0.4 mg·g-1。光照可能促進(jìn)了麥角甾醇合成同時(shí)也促進(jìn)了麥角甾醇作為前體物質(zhì)合成黃體酮、氫化可的松、VD2等,致使子實(shí)體中麥角甾醇含量下降[30]。靈芝中礦物元素的含量對食療效果及中藥藥效影響很大,微量元素是人體機(jī)體的重要組成成分,可維持細(xì)胞的滲透壓與機(jī)體的酸堿平衡,參與體內(nèi)的新陳代謝、生理、生化反應(yīng)、能量轉(zhuǎn)換等多個(gè)過程[31]。不同人群可以根據(jù)不同癥狀適當(dāng)采用靈芝補(bǔ)充所需元素,從而調(diào)節(jié)體內(nèi)微量元素的平衡、緩解癥狀,達(dá)到食補(bǔ)或藥補(bǔ)的功效。不同撫育條件下,大量元素和微量元素的分布不同,光照促進(jìn)了子實(shí)體吸收K元素,排出Na元素,同時(shí)促進(jìn)了對微量元素Fe、Sr、As等的吸收,K元素可舒張血管,預(yù)防血管方面疾病,Fe具有良好的補(bǔ)血功能。強(qiáng)光撫育條件下的靈芝子實(shí)體礦物質(zhì)元素分布可能更有利于人體對礦物質(zhì)元素的吸收。

林下菌類作物的栽培作為一種新型栽培方式,不僅可以合理地利用林下富?？臻g而且菌類作物生長與植物根系形成互惠共生關(guān)系,有利于植物生長。在合理利用森林資源的同時(shí),應(yīng)注重科學(xué)發(fā)展、科學(xué)規(guī)劃,各系統(tǒng)同步發(fā)展,在保障森林健康持續(xù)發(fā)展前提下,充分配置森林相關(guān)系統(tǒng)資源,從而促進(jìn)森林資源的可持續(xù)利用和菌類資源的仿野生化栽培,促進(jìn)生態(tài)和諧。

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