陳雄毅，岑麗蓮，梁文靜

(廣東省肇慶市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 526040)

珠蛋白生成障礙性貧血為常染色體隱性遺傳病，主要分為α-、β- 2種類(lèi)型[1]。遺傳后代不分男、女性，概率均等[2]。β-珠蛋白生成障礙性貧血是由于β-珠蛋白鏈合成減少或完全不能合成所致，其基因突變類(lèi)型有明顯的地域性，是我國(guó)南方最常見(jiàn)和危害最大的遺傳病之一。肇慶地區(qū)處于廣東中西部，為廣東省內(nèi)占地面積最大的城市，人口眾多。該院為肇慶地區(qū)第一家開(kāi)展珠蛋白生成障礙性貧血基因診斷的醫(yī)療機(jī)構(gòu)，除發(fā)現(xiàn)廣東常見(jiàn)的CD41-42(-77CT)、IVS-Ⅱ-654(C→T)、-28(A→G)、CD17(A→T)、CD71-72(+A)、βE(GAG→AAG)等，還發(fā)現(xiàn)了10種少見(jiàn)的β-珠蛋白生成障礙性貧血基因突變。報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2014年5月至2017年6月該院產(chǎn)前檢查和健康體檢的肇慶地區(qū)人群，排除急慢性失血、缺鐵性貧血等其他貧血，所有研究對(duì)象受檢時(shí)均未輸過(guò)血或者距末次輸血隔間3個(gè)月以上。共7 350例檢測(cè)標(biāo)本，男2 546例，年齡2個(gè)月至80歲,平均年齡(32.5±18．9)歲,女4 804例,年齡2個(gè)月至82歲,平均年齡(31.5±17．2)歲。

1.2儀器與試劑 邁瑞公司BC-6800全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀及其配套試劑；法國(guó)Sebia公司Capillary毛細(xì)管電泳分析儀及其配套試劑；深圳亞能生物技術(shù)有限公司β-珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測(cè)試劑盒。ABI-3730xl基因測(cè)序儀及配套BigDye Terminator試劑盒。

1.3方法 (1)血液學(xué)篩查：檢測(cè)紅細(xì)胞(RBC)個(gè)數(shù)、血細(xì)胞比容(HCT)、血紅蛋白(Hb)、紅細(xì)胞平均容積(MCV)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白(MCH)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度(MCHC)等；進(jìn)行Hb電泳，定量測(cè)定胎兒血紅蛋白(HbF)、HbA2等。貧血：Hb小于該年齡段正常值下限和(或)MCV<80 fL和(或)MCH<28 pg；Hb電泳指標(biāo)：HbA2和(或)HbF大于該年齡段上限值；或Hb電泳指標(biāo)陽(yáng)性可定義為血液學(xué)初篩陽(yáng)性。(2)β-珠蛋白生成障礙性貧血基因型檢測(cè)：血液學(xué)初篩陽(yáng)性者采用PCR-RDB法，同時(shí)檢測(cè)17種中國(guó)人常見(jiàn)的β-珠蛋白生成障礙性基因突變,包括10種雜合突變[CD41-42(-TTCT)、IVS-Ⅱ-654(C→T)、-28(A→G)、CD17(A→T)、CD71-72(+A)、βE(GAG→AAG)、CD43(G→T)、-29(A→G)、CD31(-C)、-32(C→A)]和7種不區(qū)分型別的突變[IVS-I-1(G→T)、CD27/28(+C)、-30(T→C)、CD14-15(+G)、CAP[CAP+1(A→C)/nts40-43(-AAAC)]、Int(ATG-AGG)、IVS-I-5(G→C)]。

1.4基因測(cè)序 珠蛋白生成障礙性篩查陽(yáng)性而PCR-RDB法檢測(cè)仍不能確診的基因型，均進(jìn)行直接基因測(cè)序。

1.5診斷標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)家族史、血液學(xué)篩查、基因分析、基因測(cè)序結(jié)果確定診斷為β-珠蛋白生成障礙性貧血。

2 結(jié) 果

2.1血液學(xué)篩查結(jié)果 血液學(xué)篩查7 350例標(biāo)本中，陽(yáng)性且HbA2和(或)HbF大于該年齡段上限值標(biāo)本875例，陽(yáng)性率11.9%。

2.2基因診斷結(jié)果 875例初篩陽(yáng)性標(biāo)本中，432例被確診為β-珠蛋白生成障礙性貧血，其中輕型421例，重型11例。共16種突變類(lèi)型，484個(gè)β-珠蛋白生成障礙性等位基因，其中462個(gè)等位基因?yàn)閺V東常見(jiàn)的基因突變類(lèi)型(95.5%)；22個(gè)等位基因?yàn)樯僖?jiàn)的β-珠蛋白生成障礙性貧血基因突變類(lèi)型(4.5%)。其中19個(gè)等位基因由PCR-RDB法確定，另外3個(gè)通過(guò)基因測(cè)序確定。

表1 少見(jiàn)β-珠蛋白生成障礙性貧血的篩查、基因型和表型結(jié)果

表2 少見(jiàn)β-珠蛋白生成障礙性貧血基因突變類(lèi)型和構(gòu)成比

2.3少見(jiàn)β-珠蛋白生成障礙性基因結(jié)果 22例少見(jiàn)的β-珠蛋白生成障礙性貧血基因突變攜帶者，4例為重型地貧，基因型分別為CD41-42(-TTCT)/CD43(G→T)2例，-28(A→G)/CD43(G→T)和CD41-42(-TTCT)/-29(A→G)各1例，其余18例為輕型。共檢出10種少見(jiàn)的β-珠蛋白生成障礙性貧血基因突變類(lèi)型，包括 CD43(G→T)7例，IVS-I-1(G→T)和-29(A→G)各3例，CD27/28(+C)和CD14-15(+G)各2例，CAP[CAP+1(A→C)/nts40-43(-AAAC)]、CD31(-C)、CD113(GTG→GAG)、-90(C→T)、CD37(TGG→TAG)各1例。見(jiàn)表1、2。

3 討 論

目前，世界上不同種族已發(fā)現(xiàn)至少200種β-珠蛋白生成障礙性貧血突變類(lèi)型，其中10多種為缺失型，其余均為點(diǎn)突變[3]。我國(guó)絕大多數(shù)β-珠蛋白生成障礙性貧血都是由于基因發(fā)生點(diǎn)突變所致，突變涉及基因及旁側(cè)表達(dá)順序的各個(gè)環(huán)節(jié)。主要類(lèi)型有：(1)編碼區(qū)的無(wú)義突變、移碼突變、起始密碼突變：如CD43(G→T)是無(wú)義突變密碼子，使生成的mRNA穩(wěn)定性降低或形成無(wú)功能的mRNA，從而不能合成正常的珠蛋白鏈而產(chǎn)生β0珠蛋白生成障礙性貧血。屬于此種突變類(lèi)型的還有CD27/28(+C)和CD31(-C)。(2)非編碼區(qū)IVS1和IVS2突變：如IVS1的1位(G→T)因RNA拼接處改變，致使mRNA不能準(zhǔn)確進(jìn)行加工，形成異常mRNA，表現(xiàn)為β0或β+。(3)影響轉(zhuǎn)錄的突變：這類(lèi)突變主要集中于起始位點(diǎn)上游的啟動(dòng)子TATA框，使轉(zhuǎn)錄效率降低，mRNA生成量減少而產(chǎn)生β+，-29(A→G)屬于此類(lèi)。(4)RNA裂解部位缺陷：與異常RNA加帽部位和多聚腺甘酸化信號(hào)的突變有關(guān)。(5)編碼區(qū)的外顯子突變引起剪接作用的改變：IVS正常位點(diǎn)剪接的改變，會(huì)產(chǎn)生異常mRNA。

本研究對(duì)肇慶地區(qū)1 962例篩查陽(yáng)性且HbA2≥3.5和/或HbF≥2.5的標(biāo)本進(jìn)行基因檢測(cè)，432例被確診為β-珠蛋白生成障礙性貧血，陽(yáng)性檢出率22.0%，共發(fā)現(xiàn)16種突變類(lèi)型，高于黃曉佳等[4]的11種突變類(lèi)型。本研究范圍和檢測(cè)方法：(1)除要求研究對(duì)象的珠蛋白生成障礙性貧血篩查陽(yáng)性外，還將HbA2≥3.5和/或HbF≥2.5作為納入標(biāo)準(zhǔn)。(2)采用PCR-RDB法檢測(cè)17種中國(guó)人常見(jiàn)的β-珠蛋白生成障礙性貧血基因突變類(lèi)型外，對(duì)不能確診的基因突變，再使用DNA直接測(cè)序法確定。CD113(GTG→GAG)、-90(C→T)、CD37(TGG→TAG)是通過(guò)基因測(cè)序確定，且其與CD27/28(+C)、CD31(-C)是首次于肇慶地區(qū)報(bào)道的β-珠蛋白生成障礙性貧血突變類(lèi)型。

由于β-珠蛋白生成障礙性貧血基因突變具有異質(zhì)性，在不同地區(qū)的基因突變類(lèi)型和所占的比例也有所不同,其少見(jiàn)突變類(lèi)型也如此。432例被確診為β-珠蛋白生成障礙性貧血標(biāo)本中，發(fā)現(xiàn)10種少見(jiàn)的突變類(lèi)型，共22個(gè)基因位點(diǎn)，占同期肇慶地區(qū)檢出的4.55%，高于朱春江等[5]報(bào)道的桂林地區(qū)6種少見(jiàn)突變(2.28%)，也高于王文娟等[6]報(bào)道的江蘇地區(qū)3種少見(jiàn)突變類(lèi)型和彭蘭芬等[7]報(bào)道的東莞厚街地區(qū)檢出的1種少見(jiàn)基因型。桂林地區(qū)以IVS-I-1(G→T)基因型的構(gòu)成比最高，肇慶地區(qū)檢出的少見(jiàn)突變類(lèi)型以CD43(G→T)基因型最多。-90(C→T)轉(zhuǎn)錄突變于2003年首次在國(guó)內(nèi)報(bào)道，屬于中國(guó)人的稀少突變型[8]。CD37(TGG→TAG)在國(guó)內(nèi)僅有數(shù)例報(bào)告，在中國(guó)人群的突變頻率無(wú)確切統(tǒng)計(jì)[9]。CD113(GTG→GAG)在宋春林等[10]的報(bào)道中采用β-球蛋白基因直接基因測(cè)序鑒定8例。統(tǒng)計(jì)肇慶地區(qū)少見(jiàn)β-珠蛋白生成障礙性貧血基因突變，不除外在該地區(qū)還有更多的人群存在以上突變的可能，其起源、攜帶頻率等具體情況需要收集更多相關(guān)病例,然后進(jìn)行深入的研究分析。

本研究檢測(cè)β-珠蛋白生成障礙性貧血基因突變的PCR-RDB方法可以利用多重PCR，一次性擴(kuò)增出包含突變位點(diǎn)的多個(gè)片段，并在一張膜上同時(shí)對(duì)多個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，易實(shí)現(xiàn)檢測(cè)流程的標(biāo)準(zhǔn)化[11]。但呂榮鈺等[12]報(bào)道,目前常規(guī)基因檢測(cè)方法可能低估了珠蛋白生成障礙性貧血及異常Hb病攜帶者，因此基因突變鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)依然是DNA直接測(cè)序[13]。本研究22例少見(jiàn)突變類(lèi)型中，3例是PCR-RDB法無(wú)法檢測(cè)，必須通過(guò)基因測(cè)序確定。另外，表1數(shù)據(jù)表明，血液學(xué)篩查結(jié)果有22例少見(jiàn)突變類(lèi)型都符合β-珠蛋白生成障礙性貧血Hb電泳的主要表現(xiàn)：HbF增高或者HbA2增高；1例CD43(G→T)/βN 的MCV、MCH在正常范圍，與血液學(xué)參數(shù)特點(diǎn)不相符。臨床基因檢測(cè)結(jié)果應(yīng)該結(jié)合血液學(xué)結(jié)果、Hb綜合分析，對(duì)高度懷疑β-珠蛋白生成障礙性貧血而PCR-RDB方法未能檢出的17種常見(jiàn)基因突變標(biāo)本，通過(guò)擴(kuò)增β-珠蛋白基因直接測(cè)序確定，避免漏診、誤診。

綜上所述，肇慶地區(qū)人群珠蛋白生成障礙性貧血的基因攜帶率較高，且有該地區(qū)的基因突變類(lèi)型和基因頻率分布特點(diǎn)。結(jié)合常規(guī)基因分析和基因測(cè)序，本研究發(fā)現(xiàn)10種少見(jiàn)β-珠蛋白生成障礙性貧血基因突變類(lèi)型，不但補(bǔ)充了該地區(qū)的β-珠蛋白基因突變譜，對(duì)指導(dǎo)人群篩查具有重要價(jià)值，而且為臨床醫(yī)師在診斷、優(yōu)生遺傳咨詢方面提供參考。

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