楊穎麗，呂麗榮，李 晶，李翠祥，李 瓊

(西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

土壤鹽漬化是世界面臨的嚴(yán)重環(huán)境問題之一.在世界范圍內(nèi)共有9.54億hm2的土地發(fā)生了鹽漬化[1]，中國(guó)是位于澳大利亞、前蘇聯(lián)之后的第三大鹽堿地分布國(guó)家，其次生鹽漬化土壤約占耕地面積的1/10[2].甘肅省主要受到鹽漬化影響的區(qū)域?yàn)楹游骷把攸S灌區(qū)，且土壤鹽漬化的面積在逐步擴(kuò)大[3].土壤鹽漬化會(huì)影響植物生存，造成農(nóng)業(yè)產(chǎn)量減少以及土壤生產(chǎn)能力下降[4].植物在正常生長(zhǎng)條件下，活性氧(ROS)的產(chǎn)生和清除保持平衡，因而不會(huì)造成機(jī)體的損傷.而鹽脅迫條件下，植物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的ROS，高濃度的ROS對(duì)植物細(xì)胞有很強(qiáng)的毒害，危害植物正常的生長(zhǎng)生理情況[5].抗壞血酸(AsA)-谷胱甘肽(GSH)循環(huán)是植物體內(nèi)清除ROS的重要途徑之一，主要包括4種非酶物質(zhì)即AsA、脫氫抗壞血酸(DHA)、GSH、氧化型谷胱甘肽(GSSG)和4種酶即抗壞血酸過氧化物酶(APX)、單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)和谷胱甘肽還原酶(GR).GSH作為DHA 還原的電子受體，經(jīng)DHAR還原重新生成AsA[6].AsA進(jìn)而通過氧化酶的反應(yīng)，將過氧化氫(H2O2)轉(zhuǎn)化成H2O，從而清除ROS來(lái)保護(hù)細(xì)胞免受過氧化傷害.AsA-GSH循環(huán)在植物應(yīng)對(duì)逆境條件的過程中起到了重要作用.有文獻(xiàn)報(bào)道，NaCl脅迫誘導(dǎo)酸棗幼苗根、莖、葉中AsA和DHA含量均呈升高趨勢(shì)，細(xì)胞氧化還原能力(AsA/DHA)先升高后降低，說(shuō)明酸棗幼苗各器官中可能具備較高的AsA周轉(zhuǎn)和再生能力以抵抗NaCl誘導(dǎo)的氧化脅迫[7].劉志萍等在研究中發(fā)現(xiàn)，H2O2含量與DHA和GSSG含量呈顯著正相關(guān)，表明AsA-GSH循環(huán)在減輕NaCl脅迫引起的大麥籽粒過氧化傷害過程中發(fā)揮了重要作用[8].相似地，旱柳通過調(diào)節(jié)AsA-GSH 循環(huán)和谷胱甘肽代謝來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)Cd 的耐性與解毒[9].

隴春27號(hào)和隴春30號(hào)小麥(TriticumaestivumL.)由甘肅省農(nóng)科院小麥所選育，為春性小麥，具有適應(yīng)性廣、豐產(chǎn)穩(wěn)定等特點(diǎn).不同的是，27號(hào)小麥根系發(fā)達(dá)，根毛多，株型好，穗大整齊，抗旱性強(qiáng)，耐瘠薄，綜合性狀突出；30號(hào)小麥為大穗型品種，灌漿速度快，成熟落黃好，株型緊湊，整齊度好，抗倒性強(qiáng)，群體優(yōu).目前關(guān)于這2種小麥的研究主要圍繞在培育、栽培、豐產(chǎn)性等方面，以及水分脅迫對(duì)隴春27號(hào)光合參數(shù)和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響[10].對(duì)于這2種小麥在鹽脅迫下的AsA-GSH循環(huán)的研究鮮見報(bào)道.文中以隴春27和隴春30為供試材料，分析不同濃度NaCl(0，25，100和200 mmol·L-1)脅迫下2種小麥幼苗的AsA-GSH循壞中抗氧化物含量和相關(guān)酶活性的變化，比較2種小麥在鹽脅迫下AsA-GSH循環(huán)的差異，為揭示AsA-GSH循環(huán)在植物耐鹽性的作用機(jī)理提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 植物材料的培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)材料選取春小麥新品種隴春27和隴春30(購(gòu)自甘肅省農(nóng)科院).種子表面消毒15 min(0.1%氯化汞)后，用流水沖洗至無(wú)殘留氯化汞并使種子吸足水分，黑暗中萌發(fā)24 h.種子培養(yǎng)條件為：12 h/12 h(光照/黑暗)、(24±2)℃和300 μmol·m-2·s-1，用含25,100和200 mmol·L-1NaCl 的1/4 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液脅迫處理，對(duì)照組用1/4 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液處理.幼苗生長(zhǎng)6 d后，測(cè)定有關(guān)的生理指標(biāo).

1.2 AsA,DHA,GSH和GSSG含量的測(cè)定

AsA和總抗壞血酸含量的測(cè)定參照Kampfenkel等[11]的方法.1.0 g根加入6%的三氯乙酸(TCA)，冰浴研磨，在15 000 r·min-1、4 ℃條件下離心10 min.上清液用于檢測(cè)AsA和總抗壞血酸含量.AsA含量的檢測(cè)：取0.2 mL上清液加入0.2 mmol·L-1的磷酸緩沖液PBS(pH 7.4)、10%的TCA、42%的磷酸以及4%的2,2′-聯(lián)吡啶，最后加入3%的三氯化鐵(FeCl3)，混勻于42 ℃水浴40 min，在525 nm處測(cè)定吸光值.總抗壞血酸含量測(cè)定：取0.2 mL的上清液與0.2 mmol·L-1二硫蘇糖醇(DTT)和0.2 mmol·L-1PBS(pH 7.4)混勻，隨后42 ℃溫育15 min，溫育結(jié)束后加入0.5% N-乙基馬來(lái)酰亞胺(NEM)，混勻室溫放置1 min后，再加入10%的TCA、42%的H3PO4、4%的2,2′-聯(lián)吡啶以及3%的FeCl3，于42 ℃水浴40 min，在525 nm處測(cè)定吸光值，以nmol·g-1鮮重(FW)為單位.DHA的含量為總抗壞血酸和AsA的差值.

GSH和GSSG含量的測(cè)定根據(jù)Hissn和Hilf[12]的方法.將小麥根在含有5 mmol·L-1乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)的0.1 mol·L-1PBS(pH 8.0)和25% H3PO4的反應(yīng)液中冰浴研磨，離心30 min(20000 r· min-1)，上清液留待檢測(cè).GSH含量的測(cè)定：取上清液加入含5 mmol·L-1EDTA的0.1 mol·L-1PBS(pH 8.0)，隨后加入0.1 mol·L-1的PBS(pH 8.0，含有5 mmol·L-1EDTA)和0.1%的鄰苯二甲醛，室溫放置15 min，發(fā)射光為420 nm,激發(fā)光為350 nm，測(cè)定溶液的熒光值.GSSG含量的測(cè)定：上清液中加入0.04 mol·L-1NEM后，室溫放置30 min，加入0.1 mol·L-1的NaOH，混勻.發(fā)射光420 nm,激發(fā)光350 nm，測(cè)定熒光值.以ng·mg-1FW作為GSH和GSSG含量的單位.

1.3 APX，AAO，MDHAR，DHAR和GR的酶活測(cè)定

根據(jù)Nakano和Asada[13]的方法測(cè)定APX的活性.稱取0.5 g根加入pH=7.0的5.0 mL 50.0 mmol·L-1PBS提取液，內(nèi)含1 mmol·L-1AsA和1 mmol·L-1EDTA，冰浴研磨，離心20 min(13 000 r· min-1).取適量上清液加入50 mmol·L-1PBS緩沖液(pH 7.0，含有0.5 mmol·L-1AsA)，于25 ℃水浴5 min，加入0.05% H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，以15 s為時(shí)間間隔，在290 nm處掃描1 min.APX活性以U·mg-1protein為單位.

AAO的活性參考Shen等[14]的方法測(cè)定.稱取1.0 g根加入50 mmol·L-1PBS提取液(pH 7.2，內(nèi)含2 mmol·L-1DTT、 2 mmol·L-1EDTA、2% 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和20%甘油)，冰浴研磨后在10 000 r· min-1、4 ℃的條件下離心30 min.隨后吸取0.1 mL的上清液與50 mmol·L-1PBS 溶液(pH 5.6，含5 mmol·L-1EDTA和1 mmol·L-1AsA)混勻.在265 nm處以10 s 為間隔，掃描2 min.單位時(shí)間內(nèi)(1 min)吸光值變化0.1定義為一個(gè)酶活單位.

按照Ma和Cheng[15]的方法測(cè)定MDHAR和DHAR的活性.1.0 g根加入50 mmol·L-1PBS(pH 7.6，內(nèi)含2 mmol·L-1DTT、2 mmol·L-1EDTA、2% PVP和20%甘油)，冰浴研磨后在10 000 r· min-1、 4 ℃的條件下離心30 min.MDHAR活性的檢測(cè)：將0.1 mL的上清液與50 mmol·L-1Hepes-NaOH(pH 7.6，含有0.1 mmol·L-1NADH、0.3 U AAO和0.25 mmol·L-1AsA) 混勻.隨后以10 s 為間隔，在340 nm處掃描2 min.單位時(shí)間內(nèi)(1 min)吸光值變化0.01定義為一個(gè)酶活單位.DHAR活性的檢測(cè)：將0.1 mL的上清液與100 mmol·L-1Hepes-NaOH緩沖液(pH 7.0，內(nèi)含0.6 mmol·L-1DHA和2.5 mmol·L-1GSH)混合均勻.在265 nm處以10 s為時(shí)間間隔，掃描2 min.單位時(shí)間內(nèi)(1 min)吸光值變化0.01定義為一個(gè)酶活單位.

依照Schaedle和Bassham[16]的方法測(cè)定GR活性.將0.5 g根加入到50 mmol·L-1Tris-HCl 提取液(pH 7.5，內(nèi)含0.1 mmol·L-1EDTA和0.1% PVP)，冰浴研磨，在13 000 r· min-1條件下離心30 min，吸取150 μL的上清液與3 mL的反應(yīng)液混勻.在340 nm處以30 s為時(shí)間間隔，掃描3 min.單位時(shí)間(1 min)內(nèi)吸光值變化0.1定義為一個(gè)酶活單位.GR活性以U·mg-1protein為單位.

1.4 數(shù)據(jù)分析

以上每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(SE)表示，分別用軟件SPSS和Excel對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析以及整理制圖，不同小寫字母表示有顯著性差異(P<0.05).

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對(duì)小麥根AsA和DHA含量的影響

如表1所示，鹽脅迫下2種小麥根中AsA和DHA含量均有不同程度的積累.與對(duì)照相比，AsA含量在25,100和200 mmol·L-1NaCl處理的隴春27號(hào)小麥根中分別增加約2.89，2.52和3.41倍，在隴春30號(hào)根中分別增加約1.63，1.80和2.30倍.相似地，DHA含量在不同濃度NaCl處理的27號(hào)根中都有顯著增加，而30號(hào)根在25 mmol·L-1NaCl處理下DHA含量較對(duì)照無(wú)顯著性差異，100和200 mmol·L-1NaCl處理導(dǎo)致該參數(shù)增大較為明顯.從表1也可以看出，鹽處理下2種小麥根中AsA/DHA比值均增加，且隴春27根的比值隨鹽濃度增加而增大，而隴春30根的比值隨鹽濃度增加而減小.

表1 鹽處理對(duì)小麥根AsA，DHA(nmol·g-1 FW)和 AsA/DHA的影響

注：數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示,各列中不同小寫字母表示在0.05水平有顯著差異，下同.

2.2 鹽脅迫對(duì)小麥根中GSH和GSSG含量的影響

鹽脅迫對(duì)小麥根GSH和GSSG含量的影響見表2.與對(duì)照相比，隴春27號(hào)小麥根中GSH含量在25 mmol·L-1NaCl處理下減少約 11%，而在100和200 mmol·L-1NaCl處理下分別增加約19%和77%；對(duì)于隴春30號(hào)根，GSH含量在100 mmol·L-1NaCl處理下無(wú)顯著變化，在25 mmol·L-1NaCl處理下降低約20%，在200 mmol·L-1NaCl處理下卻明顯增加.27號(hào)小麥根中GSSG含量隨著NaCl濃度的升高均呈顯著性增加，在25,100和200 mmol·L-1NaCl處理下分別增加約8%,15%和44%，在25 mmol·L-1NaCl處理的30號(hào)小麥根中GSSG的含量較對(duì)照減少約25%，其他鹽濃度處理下其含量顯著增加.此外，200 mmol·L-1NaCl處理的隴春27號(hào)和25 mmol·L-1NaCl處理的隴春30號(hào)根中GSH/GSSG比值增加，其他濃度NaCl處理的根中此比值均下降.

表2 鹽處理對(duì)小麥根GSH，GSSG(ng·g-1 FW)和 GSH/GSSG的影響

2.3 鹽脅迫下小麥根APX，AAO，MDHAR，DHAR和GR活性的變化

與對(duì)照相比，隴春27號(hào)小麥根APX活性在25 mmol·L-1NaCl處理下減少約23%，100 mmol·L-1NaCl 處理下無(wú)明顯變化，而200 mmol·L-1NaCl 處理使其增強(qiáng)約36%(表3).同樣地，APX活性在25 mmol·L-1NaCl處理的隴春30號(hào)根中下降約34%，在100 mmol·L-1NaCl處理下無(wú)顯著變化，當(dāng)NaCl處理濃度為200 mmol·L-1時(shí)，APX活性升高至對(duì)照組的138%.

AAO活性在25和100 mmol·L-1NaCl處理的隴春27號(hào)小麥中較對(duì)照分別升高約90%和93%，在200 mmol·L-1NaCl處理下無(wú)顯著變化.不同的是，隴春30號(hào)小麥根AAO活性在25 mmol·L-1NaCl處理組中無(wú)顯著變化，而在100和200 mmol·L-1NaCl處理組中AAO活性均抑制，其分別下降為對(duì)照組的87%和67%(表3).

如表3所示，MDHAR活性在25和200 mmol·L-1NaCl處理的隴春27號(hào)小麥根中較對(duì)照組降低，100 mmol·L-1NaCl處理組中無(wú)顯著變化.隴春30號(hào)小麥根MDHAR活性在25和100 mmol·L-1NaCl 脅迫下顯著升高，而在200 mmol·L-1NaCl 處理下降低.

與對(duì)照組相比，隴春27號(hào)小麥根DHAR活性在25 mmol·L-1NaCl處理下無(wú)明顯變化，隨著NaCl濃度的升高而顯著增加，分別達(dá)到對(duì)照組的2.27倍和2.01倍.不同的是，隴春30號(hào)小麥根DHAR活性隨著NaCl濃度的升高而增高(表3).

從表3可以看出，GR活性在25 mmol·L-1NaCl處理的隴春27號(hào)小麥根中無(wú)顯著性變化，100和200 mmol·L-1NaCl處理下該酶活性分別增加為對(duì)照組的118%和133%.隴春30號(hào)小麥根中GR活性在3種濃度NaCl處理下均明顯增加為對(duì)照的116%(表3).

表3 鹽脅迫對(duì)小麥根APX，AAO，MDHAR，DHAR和GR活性(U·mg-1 protein)的影響

3 討論

植物在正常生長(zhǎng)情況下，體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和清除之間會(huì)保持動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)植物在遭受高鹽逆境脅迫時(shí)，動(dòng)態(tài)平衡會(huì)被打破，ROS的含量上升，導(dǎo)致植物細(xì)胞遭受氧化損傷[17].植物防御能力的強(qiáng)弱與抗氧化系統(tǒng)水平的高低具有相關(guān)性，如抗氧化系統(tǒng)的重要組分GSH水平的降低，會(huì)導(dǎo)致植物防御能力減弱[6].AsA-GSH循環(huán)在植物抵抗逆境脅迫的過程中起著非常重要的作用，可以有效去除ROS和維持細(xì)胞內(nèi)GSH穩(wěn)態(tài)，AsA-GSH循壞由3個(gè)相互依賴的氧化還原對(duì)組成，包括AsA/DHA，GSH/GSSG以及NADPH/NADP[6].AsA是生物體內(nèi)重要的抗氧化劑，其作用為清除生物體內(nèi)H2O2，還原過氧化物，提高植物的抗氧化能力[18].Gallie 等的研究表明，AsA和DHA的含量以及AsA/DHA的比值可以反映細(xì)胞內(nèi)氧化還原的狀態(tài)，與植物響應(yīng)逆境脅迫緊密相關(guān)[19].有文獻(xiàn)表明干旱脅迫條件下冰草可以通過同時(shí)上調(diào)AsA和GSH合成以及循環(huán)代謝，增加AsA、總抗壞血酸、GSH和總谷胱甘肽的含量，從而降低干旱脅迫對(duì)植株所造成的氧化脅迫程度，使植株得以生存和生長(zhǎng)[20].本研究中鹽脅迫誘導(dǎo)下2種小麥根中AsA，DHA以及AsA/DHA比值較對(duì)照都有不同程度地增加，由此可推測(cè)小麥可能通過增加AsA的含量來(lái)消除H2O2，提高AsA-GSH循環(huán)的循環(huán)率來(lái)應(yīng)對(duì)高鹽脅迫帶來(lái)的過氧化損傷.APX以AsA和H2O2為底物，將AsA和H2O2氧化反應(yīng)成MDHA和H2O，MDHA又被進(jìn)一步氧化為DHA，而MDHA和DHA分別通過MDHAR和DHAR重新生成AsA，從而消除過量的H2O2.在王聰?shù)鹊难芯恐校蠖鼓望}品種籽粒中APX，DHAR，AsA含量以及AsA/DHA值的增幅高于同期的鹽敏感品種，或降幅低于同期的品種；而DHA含量的增幅低于同期的鹽敏感品種[21].本研究中，鹽脅迫誘導(dǎo)2種小麥根APX活性均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，而AAO活性則表現(xiàn)出相反的變化趨勢(shì).隴春27根中MDHAR活性在100 mmol·L-1NaCl處理下升高，隴春30根中在25和100 mmol·L-1NaCl處理下活性升高，最高濃度(200 mmol·L-1NaCl)處理反而使2種小麥MDHAR活性下降.隴春27號(hào)小麥根中DHAR活性在低濃度(25 mmol·L-1)的鹽脅迫下無(wú)明顯變化，隨著NaCl濃度的升高，酶活性升高.不同濃度的鹽均可誘導(dǎo)隴春30根DHAR活性升高.由上可知，鹽脅迫誘導(dǎo)2種小麥根中AsA的積累以及APX活性增加有利于清除H2O2，以減緩過量H2O2造成的氧化傷害.此外，隴春27根中AsA含量的積累可能與DHAR活性升高有關(guān)，而隴春30號(hào)AsA含量的升高可能是由于AAO活性受到抑制而MDHAR和DHAR活性增強(qiáng).

GSH是AsA-GSH循環(huán)中另一個(gè)重要的組成，植物體內(nèi)GSH的產(chǎn)生受其合成和AsA-GSH循環(huán)的調(diào)節(jié)，并且植物細(xì)胞內(nèi)GSH/GSSG比值和GSH含量是評(píng)價(jià)AsA-GSH循環(huán)運(yùn)行效率高低的重要因素[22]，GSH通過給DHAR提供電子將DHA還原成AsA，因此GSH在AsA的再生過程中起到非常重要的作用.更為重要的是，GSH是還原型谷胱甘肽，可以清除細(xì)胞代謝過程中產(chǎn)生的ROS，減少由于膜脂過氧化作用對(duì)細(xì)胞造成的傷害[23].本研究中隴春27號(hào)根中GSH的含量在25 mmol·L-1NaCl 處理組中下降，而隨著NaCl濃度的升高，其含量又顯著增加，GSSG含量隨著NaCl濃度的升高顯著增加.隴春30號(hào)GSH和GSSG含量在25 mmol·L-1NaCl處理下均降低，在100和200 mmol·L-1NaCl處理下卻有明顯的增加，且GSSG含量在最高濃度(200 mmol·L-1)鹽處理下達(dá)到最大.除了200 mmol·L-1NaCl處理的隴春27號(hào)和25 mmol·L-1NaCl處理的隴春30號(hào)GSH/GSSG比值增加，其他濃度NaCl處理中二者的GSH/GSSG比值均下降.GSH/GSSG比值的顯著下降，說(shuō)明這2種小麥根都受到了不同程度的氧化損傷.有文獻(xiàn)報(bào)道，GSSG在GR的作用下被還原形成GSH，促進(jìn)GSSG向GSH轉(zhuǎn)變[24].本研究中，鹽脅迫誘導(dǎo)2種小麥根GR活性都有不同程度的升高，從而有利于GSH的積累.較高的GSH含量可以促進(jìn)AsA的再生，由此來(lái)減緩鹽脅迫對(duì)植物的氧化損傷[23]，因此增強(qiáng)GR的活性在小麥抗氧化脅迫中發(fā)揮著重要的作用.

4 結(jié)束語(yǔ)

鹽脅迫下2種小麥根可能通過提高AsA和DHA的含量及AsA/DHA的比值提高AsA-GSH循環(huán)的循環(huán)率，增強(qiáng)了幼苗的抗氧化能力，緩解了NaCl對(duì)小麥幼苗造成的氧化損傷.此外，鹽誘導(dǎo)的隴春27根中AsA的積累可能與DHAR活性升高有關(guān)，而隴春30號(hào)AsA含量的增加可能是由于AAO活性的抑制及MDHAR和DHAR活性的增強(qiáng).

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