梁 娜,桑亞新,周 妍,劉衛(wèi)華,李田葉,王向紅

(河北農業(yè)大學食品科技學院,河北保定 071000)

姜,盛產于亞洲,特別是中國南部和印度地區(qū)[1]。干姜為姜科植物姜(ZingiberofficinaleRosc.)的干燥根莖,其加工過程包括凈制、切制和炮制,以四川犍為產品最佳[2]。藥理研究表明干姜具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗?jié)?、?zhèn)痛、利膽等作用[3-4]。干姜主要的功能因子為姜辣素,它是有刺鼻氣味的一種弱極性的酚類混合物,包括姜酚、姜烯酚、姜酮等,是黃色油狀液體,味辣而苦,是姜特征性風味的主要呈味物質[5-7]。研究表明,無論是體外還是在體內實驗姜辣素都體現(xiàn)了抗癌、抗氧化等藥理活性[8],具有良好的應用前景和社會效益[9-11]。

當前,很多學者在研究姜辣素或姜中有效成分的檢測方法[12-16],現(xiàn)報道的姜辣素檢測方式一般為高效液相色譜法(HPLC)、反相高效液相色譜(RP-HPLC)、氣相色譜-質譜聯(lián)用(GC-MS)。王維皓等人[15]利用HPLC方法僅測定了生姜中6-姜辣素含量,由于姜辣素是一類酚類混合物,所以對其他姜辣素類化合物物質的分析還有待研究。張永鑫等人[14]建立了姜及其炮制品中姜辣素類化合物含量的測定方法(HPLC),但此方法未能成功檢測到含量相對較低的姜酮,在以后的研究中還需提高其檢測靈敏度。雖然GC-MS技術已廣泛應用于姜的分析且可分析出低含量的物質[17-18],但由于姜辣素的低揮發(fā)性,樣品處理方面較為復雜且可能會出現(xiàn)分析不全

面的問題。然而,液質聯(lián)用技術(LC-MS)可以很好地解決上述所有問題。李峰武[19]用HPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS的方法靈敏、簡便快速的分析延胡索水提物中的化學成分,駱宜等人[20]同樣利用液質聯(lián)用技術高效、準確的鑒定了決明子中的化學成分。由此可見,液質聯(lián)用(LC-MS/MS)分析技術是一種簡便、快速的分析方法,在食品分析、環(huán)境分析和醫(yī)藥研究等許多領域已得到了廣泛應用[21-23]。本實驗不僅僅局限于姜辣素化合物單一成分的測定,還將對姜辣素類化合物的組成進行分析,并采用液相色譜-質譜聯(lián)用(LC-MS)技術對姜辣素類化合物進行分離。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干姜,生姜 保定安國中藥材批發(fā)市場;乙腈 色譜純,天津科密歐試劑有限公司;6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚、10-姜酚 色譜純,上海源葉生物科技有限公司。

液相色譜-離子阱飛行時間串聯(lián)質譜儀 日本島津公司;Agilent 1200型高效液相色譜儀 美國安捷倫有限公司;RE-52A型旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;QTSX6150超聲波清洗器 天津市瑞普電子儀器公司;TGL16M離心機 長沙易達儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 姜辣素的制備 將購買的同一批次的干姜粉碎后過60目篩,篩分于干燥器中保存?zhèn)溆?。精密稱取制備好的粉末約1.0 g,加入40 mL甲醇,超聲處理30 min,重復超聲一次,取上清液4500 r/min離心10 min,將離心后的上清液,移入梨形瓶中,將殘渣重復離心操作一次,合并離心液旋轉蒸發(fā)至干,加入1 mL甲醇復溶,過有機微孔濾膜(0.45 μm)[15],待用。

1.2.2 LC-MS法分離鑒定姜辣素類化合物

1.2.2.1 色譜條件 色譜柱:Syncronis C18(5 μm×250 mm×4.6 mm);流動相:乙腈(A相)和0.1%甲酸水(B相),流動相梯度見表1;流速:0.3 mL/min;柱溫40 ℃;進樣量:2 μL;采樣時間:15 min。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of mobile phase

1.2.2.2 質譜條件 采用全離子掃描模式方式,電噴霧離子源(ESI),離子源溫度:200 ℃;霧化氣體流速:1.5 L/min;脫溶溫度:200 ℃;掃描范圍:100～1000 m/z;掃描時間:15 min。

1.2.2.3 樣品測定 按“1.2.2.1”條件下對樣品進行姜辣素類物質的定性分析,并利用相同的提取檢測方法對同一產地的生姜姜辣素也進行了對比分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運用Office軟件進行分析。

2 結果與討論

2.1 樣品測定

本文用液相色譜確定了干姜姜辣素中5種物質的基本含量,同時與生姜的姜辣素進行了對比分析,結果見表2?？煽闯龈山慕彼睾棵黠@的高于生姜,證明干姜的加工方式會增加其有效成分的含量,提高其利用價值。

表2 干姜姜辣素液相測定結果(n=6)Table 2 The content of gingerols in dried ginger(n=6)

2.2 干姜中姜辣素類化合物LC-MS分析

與水組合時乙腈的分離效果和洗脫效果都較好;選用流動相為乙腈和0.1%甲酸水進行梯度洗脫得到了如圖1、圖2所示的液相結果圖。由圖可知,在此液相條件下,各化合物分離度高、峰型較好、信號較強,可以實現(xiàn)干姜總提取物的良好分離。

圖1 姜辣素標準品液相圖Fig.1 Liquid phase diagram of gingerol standard

圖2 干姜樣品液相圖Fig.2 Liquid phase diagram of dried ginger sample

本實驗采用了LC-MS的分析方法對干姜姜辣素類化合物進行了質譜分析,其總離子流圖如圖3所示。同時,把5種姜辣素類化合物的標準品做了液質分析,總離子流圖如圖4所示,用于對比分析樣品中姜辣素類化合物的成分。對干姜姜辣素樣品進行正、負離子模式分析,發(fā)現(xiàn)姜酮、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚在負離子模式下具有較好的質譜響應,而6-姜烯酚在正離子模式下具有較高的質譜響應。所以,以負離子模式為主要結果分析姜酮、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚,而6-姜烯酚則以正離子模式為主要依據(jù)進行分析鑒定。而后,分析5個譜峰的準分子離子峰(圖5)和二級質譜碎片離子峰的精確質量信息,再結合標準品總離子流圖以及一、二級質譜圖和相關參考相關文獻對干姜中的5種化合物進行準確鑒定,結果見表3。

圖3 干姜樣品總離子流色譜圖Fig.3 Total ion chromatogram of dried ginger sample

圖4 姜辣素標準品總離子流色譜圖Fig.4 Total ion chromatogram of gingerol standard

圖5 干姜樣品質譜圖姜酮(1)、6-姜酚(2)、 8-姜酚(3)、6-姜烯酚(4)、10-姜酚(5)Fig.5 Mass spectrum of dried ginger samples Zingerone(1),6-gingerol(2),8-gingerol(3)，6-shogaol(4),10-gingerol(5)

表3 干姜姜辣素的HPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS分析Table 3 Analysis of gingerols in dried ginger with HPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS

圖3在保留時間6.567 min附近有峰1,在m/z 193.0933產生[M-H]-峰即姜酮的特征離子峰(圖5-(1)),m/z 137.0570表示的是姜辣素類化合物的主要化學成分及4′-羥基-3′-甲氧基苯官能團[11,18]。初步判定該物質為姜辣素類化合物中的一種,且分子量為194.2271。查閱CAS號可知姜酮(CAS:122-48-5)的分子量為194.23,理論值與液質測定值相差1.5×10-5,結果可信準確。由此可以得知經甲醇提取的干姜姜辣素類化合物中含有少量的姜酮,因其含量很少所以液相并沒有檢出,表明相對于液相色譜的檢測方法,液質聯(lián)用的方法靈敏度和分離度更高。

圖3在保留時間8.240 min處出現(xiàn)分子離子峰2,在m/z 293.1770產生[M-H]-峰(圖5-(2)),同樣在二級質譜碎片離子峰中也出現(xiàn)了姜辣素類化合物的基本峰m/z 137.0488,分析可知其分子質量為294.1736,又因其出現(xiàn)了6-姜酚的特征離子峰m/z 293.1770可推測該物質為6-姜酚,分子式為C17H26O4。查閱Spectral Database for Organic Compounds(SDBS)和參考文獻[24]可知6-姜酚的分子質量為294.4,運用本方法的實際測定值與理論值相差7.7×10-4。

圖3在保留時間9.233 min處出現(xiàn)分子離子峰3,在m/z 321.2064出現(xiàn)8-姜酚特征離子峰(圖5-(3)),二級質譜中發(fā)現(xiàn)有姜辣素類化合物的基本峰m/z 137.0489,判斷其分子量為322.2073,推測該物質為8-姜酚,分子式C19H30O4。查閱SDBS可知8-姜酚的分子質量為322.4,運用本方法的實際測定值與理論值相差6.0×10-4。

圖3在保留時間9.620 min處出現(xiàn)分子離子峰4,在m/z 277.1842產生[M+H]+峰即6-姜烯酚的特征離子峰(圖5-(4)),二級質譜中存在姜辣素類化合物的基本峰m/z 137.0489,由此判斷該物質為6-姜烯酚,其分子量為276.1793,分子式C17H24O3。

圖3在保留時間10.246 min處出現(xiàn)分子離子峰5,在m/z 349.2398產生[M-H]-峰(圖5-(5)),二級質譜中有姜辣素類化合物的基本峰m/z 137.0489,根據(jù)特征離子峰判斷該物質為10-姜酚,其分子量為350.2378,分子式C21H34O4。查閱SDBS可知10-姜酚的分子質量為350.5,實際測定值與理論值相差7.5×10-4。

綜上,LC-MS的檢測方法可以檢測出含量較少的姜酮,證明其靈敏度精確度要高于單獨的HPLC檢測。本文所述的HPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS檢測方法精確度較高。并且,對比王麗等人[11]、芮雯等人[25]所用到的方法,本文的檢測方法用時較少,更高效,可以更廣泛地運用到其他姜制品的姜辣素檢測中。

2.3 方法的線性關系及最低檢出限

取混合標準品溶液適量,以色譜純甲醇分別稀釋成濃度為1、5、10、12.5、25、50、100、125、200 μg/mL的溶液,在上述液相條件下進樣10 μL測定。以標準品濃度為橫坐標,峰面積積分為縱坐標,進行線性分析。

姜辣素線性關系及最低檢出限結果見表4,在0～200 μg/mL范圍內五種姜辣素類物質得到的線性方程中R2均達到0.9992以上,表明線性關系良好。分析五種姜辣素類物質的最低檢出限值,分析可知儀器狀態(tài)良好,色譜方法有效可信。

表4 姜辣素線性關系及最低檢出限結果(n=6)Table 4 Gingerol linear relationship and the limit of detection(n=6)

2.4 回收率與精密度

取混合標準品溶液125 μg/mL、連續(xù)進樣6次,每次進樣10 μL,記錄其保留時間和峰面積,計算姜酮、6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚、10-姜酚的峰面積的相對標準偏差RSD值來評判此方法的精密度。取同一樣品溶液,按“1.2.1”方法制備供試品溶液,分別于0、2、4、8、12、24 h以10 μL進樣測定,考察其是否穩(wěn)定并分析保留時間和峰面積,計算姜酮、6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚、10-姜酚的峰面積的相對標準偏差值評測方法的穩(wěn)定性。稱取已知含量的同一姜樣品5份,每份約1 g,準確計算樣品中姜酮、6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚、10-姜酚的含量并分別加入相應含量的姜辣素單標對照品,按“1.2.1”方法制備供試品溶液,進樣10 μL進行分析,計算其加標回收率。

如表5,由精密度實驗可知:通過5種代表性姜辣素類物質的連續(xù)6次進樣分析,發(fā)現(xiàn)其相對標準偏差RSD值較小,表明該法測定姜辣素類物質精密度良好,從而能進一步證明了本研究方法的可行性。

表5 精密度、穩(wěn)定性、加標回收率實驗結果(n=6)Table 5 The results of precision and stability and sample recovery rate test(n=6)

3 結論

本文建立了一種液相色譜-電噴霧-離子阱飛行時間串聯(lián)質譜的方法,成功分析了干姜姜辣素類化合物中的5種主要成分,分別是姜酮、6-姜酚、6-姜烯酚、8-姜酚、10-姜酚。此方法在11 min內快速準確地分離出了5種主要的姜辣素類化合物,前處理過程簡單且所需樣品量少,5種姜辣素標樣在設定濃度范圍內均線性良好(R2≥0.9992),加標回收率均在95.48%～99.46%之間,實驗重復性和儀器精密度較好。

相對比HPLC的檢測方法,LC-MS的方法檢測出了含量較低的姜酮,同時也準確的檢測到了其他四種姜酚化合物,體現(xiàn)了較高的分離度和靈敏度?？梢詫⒋朔椒ㄟ\用到更多的姜及姜類炮制品中姜辣素類化合物的檢測中。

[1]Semwal RB,Semwal DK,Viljoen AM,et al. Gingerols and shogaols:Important nutraceutical principles from ginger[J]. Phytochemistry,2015:117:554-568.

[2]周靜,楊衛(wèi)平. 干姜的臨床應用及藥理研究進展[J]. 云南中醫(yī)中藥雜志,2011(2):70-72.

[3]于華蕓,吳智春,季旭明,等. 干姜溫中功效的分子機制[J]. 中華中醫(yī)藥雜志,2012(1):184-186.

[4]Nilesh Pawar,Sandeep Pai,Mansingraj Nimbalkar,et al. RP-HPLC analysis of phenolic antioxidant compound 6-gingerol from different ginger cultivars[J]. Food Chemistry,2011,126(3):1330-1336.

[5]項敏,郭嘉,劉競博,等. 姜辣素提取與分離純化工藝的研究進展[J]. 化學與生物工程,2015(5):7-10,13.

[6]趙晉. 生姜姜辣素的提取及其功能性質研究[D].重慶:西南大學,2008.

[7]Farzad Shidfar,Asadollah Rajab,Tayebeh Rahideh,et al. The effect of ginger(Zingiberofficinale)on glycemic markers in patients with type 2 diabetes[J]. Journal of Complementary and Integrative Medicine,2015,12(2).

[8]Hong-bo Mi,Xin Guo,Jian-rong Li. Effect of 6-gingerol as natural antioxidant on the lipid oxidation in red drum fillets during refrigerated storage[J]. LWT-Food Science and Technology,2016,74:70-76.

[9]蔣蘇貞,宓穗卿,王寧生. 姜辣素的化學成分研究概述[J].中藥新藥與臨床藥理,2006(5):386-389.

[10]Sushila Bhattarai,Van Hoan Tran,Colin Charles Duke. The

stability of gingerol and shogaol in aqueous solutions[J]. Journal of Pharmaceutical Sciences,2001,90(10):1158-1664.

[11]王麗,方磊,趙恒強,等. 高效液相色譜-電噴霧四級桿飛行時間質譜分析生姜中的姜辣素類化合物[J]. 中國中藥雜志,2011(24):3467-3471.

[12]S Yudthavorasit,K Wongravee,N Leepipatpiboon. Leepipatpiboon characteristic fingerprint based on gingerol derivative analysis for discrimination of ginger(Zingiberofficinale)according to geographical origin using HPLC-DAD combined with chemometrics[J]. Food Chemistry,2014:158:101-111.

[13]周記磊,韋紅言,梁冰麗,等. HPLC法測定生姜配方顆粒中6-姜辣素的含量[J]. 中藥與臨床,2013(5):6-7,19.

[14]張永鑫,李俊松,陳麗華,等. 高效液相色譜法同時測定姜及其不同炮制品中5種姜辣素的含量[J]. 中國藥學雜志,2012(6):471-474.

[15]王維皓,王智民,徐麗珍,等. HPLC法測定生姜中有效成分6-姜辣素的含量[J]. 中國中藥雜志,2002(5):31-32.

[16]陳艷,周冬翠,張梅. 三種方法提取生姜有效部位群并測定6-姜辣素含量[J]. 中國藥師,2014(7):1099-1102.

[17]梅樹蓮,鄭秋霞,鄒綱明. 姜精油的GC-MS分析[J]. 吉林化工學院學報,2005(1):11-12,35.

[18]戰(zhàn)琨友,王超,徐坤,等. 氣相色譜-質譜技術分析姜油樹脂中的揮發(fā)性及非揮發(fā)性成分[J]. 色譜,2008(6):692-696.

[19]李峰武. 高效液相色譜-電噴霧-四級桿-飛行時間串聯(lián)質譜法分析延胡索水提物中的化學成分[J]. 西北藥學雜志,2017,32(1):13-17.

[20]駱宜,張樂,王衛(wèi)華,等. 高效液相色譜-離子阱-飛行時間質譜鑒定決明子化學成分[J]. 藥物分析雜志,2015(8):1408-1416.

[21]Jiang H,Sólyom A M,Timmermann B N,et al. Characterization of gingerol-related compounds in ginger rhizome(ZingiberofficinaleRosc.)by high-performance liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry[J]. Rapid Communications in Mass Spectrometry,2005，19(20)：2957-2964.

[22]陳曉雨,李銀峰,林秀云,等. LC-MS技術在化學藥雜質分析中的研究進展[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床,2014(6):696-700.

[23]姜艷彬,單吉浩,王瑩,等. LC-MS/MS技術在藥物代謝研究中的應用進展[J]. 藥物分析雜志,2014(3):385-391.

[24]薛文靜,張燕,楊龍華,等. UPLC-MS/MS測定姜辣素中的6-姜酚[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志,2010(9):2178,2181.

[25]芮雯,馮毅凡,吳妍,等. 干姜油中姜酚類成分的UPLC/Q-TOFMS分析[J]. 中草藥,2008(5):667-668.

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