張 蕾， 張 琨， 王德利， 任小紅，崔 娜， 劉 洋，趙庭勛

(1.牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院制藥工程系，黑龍江 牡丹江157011；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院研究中心，吉林 長春 130041 ；3. 吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物實(shí)驗(yàn)示范中心，吉林 長春 130012；4. 中國科學(xué)院上海藥物研究所藥物制劑中心，上海 201210)

非酒精性脂肪肝病( non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)經(jīng)常伴隨中心性肥胖、高血脂癥、胰島素抵抗以及糖耐量異常等代謝綜合征，嚴(yán)重危害人類健康[1-4]。近年來，對NAFLD的研究很多，但其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。因此，尋找有效的治療NAFLD藥物非常重要。樺褐孔菌 (Phaeoporusobliquus)又稱白樺茸，其化學(xué)成分包括多糖類化合物、芳香物質(zhì)、多酚類化合物和三萜類化合物等物質(zhì)[5-8]，具有重要的藥用價值。從16世紀(jì)至今，樺褐孔菌一直被作為一種民間藥物，在防治糖尿病、高血壓、艾滋病以及抗癌和抗衰老等方面具有顯著的效果，但不良反應(yīng)較多[9-10]，目前有關(guān)樺褐孔菌對NAFLD的治療作用尚未見相關(guān)研究報道。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M臨床上NAFLD的病理特點(diǎn)，優(yōu)化提取樺褐孔菌皂苷提取物，并將其作用于HepG2細(xì)胞，從細(xì)胞水平評價樺褐孔菌皂苷提取物對細(xì)胞脂質(zhì)堆積的作用以及對細(xì)胞中甘油三酯(TG)水平的影響，從而探討其在防治NAFLD方面的藥用價值，為開發(fā)預(yù)防和治療NAFLD的藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器

HepG2 細(xì)胞由哈爾濱工業(yè)大學(xué)贈送，為實(shí)驗(yàn)室傳代保存。樺褐孔菌購于黑龍江省綏芬河市。MTT溶液、TG試劑盒、油酸、油紅O公司和細(xì)胞裂解液購于上海源葉生物科技有限公司，DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、血清和胰蛋白酶購于美國Hylone公司，乙醇和異丙醇購于北京化工廠。粉碎機(jī)(戴聲設(shè)備有限公司)，超聲波清洗機(jī)(杭州法蘭特超聲波科技有限公司)，電子天平(QUINTIX224-1CN Sartorius，R210，德國賽多利斯公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(R300，瑞士BUCHI有限公司)，電子顯微成像系統(tǒng)(CX31，日本Olympus公司)，酶標(biāo)儀(美國Synergy HTX BioTek公司)，靜音混合器(MT-360，中國其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.2 樺褐孔菌皂苷的提取和總皂苷水平測定

將樺褐孔菌粉末過篩，取更細(xì)膩的粉末后準(zhǔn)確稱取5 g，采用30%乙醇將其溶解，根據(jù)設(shè)定的時間、溫度、料液比和超聲波功率處理，用80%乙醇沉淀多糖，4 000 r·min-1離心5 min，取上清液，減壓濃縮至浸膏后水浴蒸干，30 mL去離子水溶解，依次用等體積正丁醇溶液萃取3～5次，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將提取的正丁醇層萃取液進(jìn)行減壓濃縮并蒸干處理后，得粗品樺褐孔菌總皂苷。參照文獻(xiàn)[11-12]測定皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定總皂苷水平。

1.3 單因素試驗(yàn)檢測樺褐孔菌皂苷提取量的影響因素

設(shè)計樺褐孔菌皂苷提取物單因素實(shí)驗(yàn)的變量條件分別為提取時間、提取溫度、料液比和超聲頻率，從而確定正交實(shí)驗(yàn)中各因素的水平。

1.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用正交試驗(yàn)表L9(34)進(jìn)行四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，各因素和水平見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.5 MTT法檢測HepG2細(xì)胞存活率

復(fù)蘇HepG2細(xì)胞，將實(shí)驗(yàn)室凍存的HepG2細(xì)胞從液氮罐中取出，迅速置于37 ℃水浴鍋中融化，用PBS清洗后，1 000 r·min-1離心去上清后將其置于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件：37 ℃、5% CO2和飽和濕度。將培養(yǎng)好的HepG2細(xì)胞每隔1 d進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并將處于對數(shù)生長期細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含10% FBS的高糖型DMEM培養(yǎng)基備用。

將處于對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，利用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，使每孔細(xì)胞的接種量達(dá)到104個，置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。設(shè)對照組和給藥組，給藥組樺褐孔菌皂苷提取物終濃度分別為 60.000、6.000、0.600、0.060和0.006 g·L-1，每組設(shè)置3個平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入5 g·L-1MTT溶液10 μL，繼續(xù)在37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后取出，緩慢吸去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO，振蕩5～10 min，于酶標(biāo)儀490 nm處測定吸光度(A)值。根據(jù)測得的A值計算細(xì)胞存活率，選擇細(xì)胞存活率達(dá)到70%以上時的樺褐孔菌皂苷濃度為安全濃度。細(xì)胞存活率= 給藥組A值/對照組A值×100%。

1.6 細(xì)胞中TG清除率的檢測

給藥組樺褐孔菌皂苷提取物終濃度分別為0.006、0.060和0.600 g·L-1，不給藥無細(xì)胞的空白孔為對照組，不給藥含HepG2細(xì)胞孔為模型組。細(xì)胞中TG水平檢測參照文獻(xiàn)[13-15]對細(xì)胞中TG水平的測量法。TG清除率 = (不給藥組A值-給藥組A值) /不給藥組A值×100%，A值為酶標(biāo)儀在500 nm處的讀數(shù)。

1.7 油紅O染色檢測各組細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)

油紅O工作液配制：首先配制0.5%油紅O儲備液，將油紅O粉末溶于異丙醇中，儲備液用蒸餾水稀釋后過濾2次，至液體澄清為止[16-17]。

將 HepG2細(xì)胞接種于24孔板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后取出，分為對照組，模型組，低、中和高濃度(0.600、0.060和0.006 g·L-1) 樺褐孔菌皂苷組，各組所加培養(yǎng)基同“1.6”中所述。孵育24 h后用油紅O工作液染色30 min，蒸餾水反復(fù)吹洗2次后，在倒置顯微鏡下觀察染色效果。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 樺褐孔菌皂苷類物質(zhì)提取的單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 樺褐孔菌皂苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線 配制人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為10、20、30、40、50、60和70 mg·L-1，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.006x+0.013，R2=0.999。

2.1.2 提取時間、超聲功率、提取溫度和料液比時樺褐孔菌皂苷類物質(zhì)的提取率 提取時間為30 min、超聲功率為30%、提取溫度為40℃、料液比達(dá)到1∶20時樺褐孔菌皂苷提取率最大(圖1)。因此，選擇提取時間為20～40 min 、超聲功率為30%～50%、提取溫度為30℃～50℃、料液比為1∶10～1∶20為進(jìn)一步優(yōu)化條件。

A:Extraction time;B: Ultrasonic power; C:Extraction temperature; D:Solid-liquid ratio.

2.2 樺褐孔菌皂苷類物質(zhì)提取的正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.2.1 皂苷提取正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計和結(jié)果 通過正交實(shí)驗(yàn)確定樺褐孔菌皂苷的最佳提取工藝。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：影響樺褐孔菌皂苷類物質(zhì)提取量的因素主次順序?yàn)槌暪β?提取溫度>提取時間>料液比(D>C>A>B)，即超聲功率和超聲溫度對樺褐孔菌皂苷提取效果影響相對較大，最佳超聲功率和提取溫度時樺褐孔菌皂苷提取率最大；與提取時間和料液比比較，最佳超聲功率和提取溫度時樺褐孔菌總皂苷提取率達(dá)到最大(P<0.05)。綜合以上條件，樺褐孔菌皂苷的最佳提取條件為：A2B2C1D2，即按1∶15 的料液比在溫度 30℃下提取 30 min，超聲功率為50%，乙醇濃度為30%。見表2。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)各因素顯著性分析 對正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，各因素對皂苷提取率影響的結(jié)果表明：提取時間、超聲功率、提取溫度和料液比對提取率有影響。見表2。

表2 樺褐孔菌皂苷正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 各組HepG2細(xì)胞存活率

隨著樺褐孔菌皂苷濃度的增加，HepG2細(xì)胞存活率降低，說明樺褐孔菌皂苷對細(xì)胞有一定的毒害作用。當(dāng)濃度小于0.600 g·L-1時，細(xì)胞存活率>70%，對細(xì)胞毒害作用相對較小，為了研究樺褐孔菌皂苷對細(xì)胞脂肪堆積的影響，將樺褐孔菌皂苷給藥濃度設(shè)定為0.006～0.600 g·L-1。見表3。

表3 各組HepG2細(xì)胞存活率

2.4 各組 HepG2 細(xì)胞中TG清除率

為減少高濃度樺褐孔菌皂苷對細(xì)胞的毒性作用，選擇小于0.600 g·L-1濃度作為實(shí)驗(yàn)濃度。 與對照組比較，模型組HepG2 細(xì)胞中TG水平明顯升高(P<0. 05)，表明 HepG2 細(xì)胞脂肪堆積模型成功建立[14]。與模型組比較，0.060 g·L-1樺褐孔菌皂苷組HepG2細(xì)胞中TG 水平升高(P<0.05)；與模型組比較，0.600 g·L-1樺褐孔菌皂苷組HepG2 細(xì)胞中TG 水平升高(P<0.01)，并隨著樺褐孔菌皂苷濃度升高，TG 清除率也逐漸升高，具有劑量依賴性，其中0.600 g·L-1樺褐孔菌皂苷組細(xì)胞中TG 清除率最高，達(dá)到32.22%。見表4。

表4 各組HepG2 細(xì)胞中TG清除率

GroupConcentration(g·L-1)Level of TG (m/mg)Clearance rateof TG(η/%)Control 00.462±0.5630Model0 1.746±0.631*0Treat-ment0.0061.663±0.4804.700.0601.482±0.437△15.120.6001.189±0.546△△32.22

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05,△△P<0.01 compared with model group.

2.5 各組HepG2中脂質(zhì)堆積情況 與對照組比較，模型組細(xì)胞中出現(xiàn)大量的紅色脂滴，同時伴隨相互融合現(xiàn)象，說明成功地建立細(xì)胞脂肪堆積模型，并隨著樺褐孔菌皂苷濃度的升高，HepG2細(xì)胞中紅色脂滴數(shù)目逐漸減少，且脂滴體積變小。在各濃度樺褐孔菌皂苷組中，0.006 g·L-1樺褐孔菌皂苷組的作用效果不明顯; 與模型組比較，0.060 g·L-1樺褐孔菌皂苷組細(xì)胞中脂質(zhì)堆積情況稍有改善，細(xì)胞中脂質(zhì)相互融合的現(xiàn)象明顯減輕; 0.600 g·L-1樺褐孔菌皂苷組細(xì)胞中脂質(zhì)堆積現(xiàn)象明顯減輕，并發(fā)現(xiàn)脂滴數(shù)目明顯減少。見圖3(插頁四)。

3 討 論

NAFLD發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢，已經(jīng)成為一種嚴(yán)重危害人類健康的世界性疾病。NAFLD 是導(dǎo)致肝功能異常的主要原因，肝臟脂肪積聚是其典型特征，但并不能采用單一機(jī)制解釋其發(fā)病的機(jī)制。TG是NAFLD患者肝臟中蓄積的主要脂質(zhì)，是體內(nèi)TG合成與轉(zhuǎn)化失衡的結(jié)果[18]。

因?yàn)橛坞x脂肪酸中含油酸水平最高，所以選擇油酸來誘導(dǎo)建立肝細(xì)胞脂肪堆積模型，符合NAFLD形成的病理生理過程，楊林輝等[19]采用1 mmol·L-1油酸誘導(dǎo)細(xì)胞 24 h 后，成功建立肝細(xì)胞脂肪堆積模型。采用上述誘導(dǎo)方法建立HepG2細(xì)胞脂肪堆積模型，可使細(xì)胞中TG大量堆積，但細(xì)胞損傷不嚴(yán)重，細(xì)胞狀態(tài)良好。因此，本課題組選取1 mmol·L-1油酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的脂肪堆積，并可產(chǎn)生氧化應(yīng)激狀態(tài)。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過正交實(shí)驗(yàn)得到樺褐孔菌皂苷的最佳提取條件(A2B2C1D2)，將提取的樺褐孔菌皂苷提取物作用于HepG2細(xì)胞，并選擇NAFLD常規(guī)檢測指標(biāo)評價樺褐孔菌皂苷對細(xì)胞中脂肪堆積的作用效果。本研究結(jié)果顯示：樺褐孔菌皂苷提取物在質(zhì)量濃度0.600 g·L-1時均對HepG2細(xì)胞增殖無明顯影響，0.600 g·L-1樺褐孔菌皂苷對油酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂肪累積具有促進(jìn)作用，隨著濃度的增加可明顯降低細(xì)胞中TG的累積，量效關(guān)系明顯。與模型組比較，0.600 g·L-1樺褐孔菌皂苷組HepG2細(xì)胞中TG水平降低，細(xì)胞中TG清除率可達(dá) 32.22%，并且具有劑量依賴性。油紅O染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：3個濃度樺褐孔菌皂苷提取物均可以改善細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積的現(xiàn)象，其中0.600 g·L-1樺褐孔菌皂苷組中脂滴數(shù)目明顯減少，說明細(xì)胞中脂質(zhì)堆積現(xiàn)象明顯減輕，研究者[17,20-21]在探討澤瀉湯對油酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂肪堆積的抑制作用實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)澤瀉湯可以改善細(xì)胞中脂質(zhì)堆積現(xiàn)象，這與本研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果表明：樺褐孔菌皂苷提取物具有一定的清除細(xì)胞中脂肪堆積的作用，本文作者推測其在脂肪肝治療方面也具有潛在的藥用價值，但目前樺褐孔菌皂苷的降脂機(jī)制尚未明確，具體的降脂機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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