檢測(cè)莠去津殘留試劑盒的研制

◎ 扶 勝，羅維超，袁學(xué)偉，周 艷，鄧小霞

（貴州勤邦食品安全科學(xué)技術(shù)有限公司，貴州 貴陽(yáng) 550009）

莠去津是目前世界上使用范圍最廣、使用量最大的選擇性內(nèi)吸前導(dǎo)型苗前、苗后除草劑，主要用于玉米和高粱等糧食作物以及果園和林地等的除草[1]。莠去津具有毒性，易通過(guò)食物進(jìn)入人體，對(duì)人體的神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)具有毒性以及遺傳毒性[2]，目前被列為國(guó)際環(huán)境優(yōu)先控制污染物[3-4]。而在農(nóng)產(chǎn)品的進(jìn)出口貿(mào)易、食品和環(huán)境安全的監(jiān)督檢測(cè)中出現(xiàn)的檢測(cè)技術(shù)性空缺，嚴(yán)重影響了我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品的出口[5]。因此，研發(fā)一種適合于大批量農(nóng)產(chǎn)品的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的產(chǎn)品具有及其重要的意義。

目前，莠去津殘留的檢測(cè)方法有氣相色譜法（GC）[6]、氣相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)用法（GC-MS）、高效液相色譜法（HPLC）和分子印跡技術(shù)等，這些技術(shù)方法檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)，但是比較耗時(shí)，過(guò)程較為繁瑣，主要是樣品前處理步驟需要大量的時(shí)間，同時(shí)儀器檢測(cè)方法所需的大型儀器和設(shè)備耗資巨大，對(duì)實(shí)驗(yàn)操作人員的專業(yè)程度要求較高，無(wú)法實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)大規(guī)模樣品的快速檢測(cè)。

與之相比，酶聯(lián)免疫方法也具有特異性好、靈敏度高的特點(diǎn)，同時(shí)酶聯(lián)免疫分析方法還具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)成本低、檢測(cè)用時(shí)較短、對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的專業(yè)程度無(wú)特殊要求等特點(diǎn)，適合于批量樣品的篩選檢測(cè)，普通人員只需稍微培訓(xùn)即可上手進(jìn)行操作檢測(cè)，能夠滿足各階層人員以及企業(yè)或相關(guān)部門對(duì)食品安全快速檢測(cè)。目前，在ELISA分析領(lǐng)域有不少的報(bào)道，王彩虹等通過(guò)合成人工抗原并制備出單克隆抗體的研究該方法建立的間接ELISA檢測(cè)莠去津的方法，最低檢測(cè)限量達(dá)到了ng級(jí)，奠定了食品中莠去津殘留檢測(cè)的基礎(chǔ)；生威等建立了一種快速檢測(cè)玉米中莠去津殘留的酶聯(lián)免疫分析方法；Barchanska等應(yīng)用酶聯(lián)免疫方法對(duì)奶中莠去津殘留進(jìn)行了監(jiān)測(cè)。目前，尚未有關(guān)于該方法應(yīng)用于莠去津在甜料甘蔗中殘留的檢測(cè)相關(guān)報(bào)道，因此，本研究相關(guān)的成果可為莠去津在食品中的殘留快速檢測(cè)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雌性Balb/c小鼠（6～8周齡），北京勤邦生物技術(shù)有限公司；莠去津標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）、牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、氫氧化鈉、三聚氯氰，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；4-氨基丁酸，上海麥克林生化科技有限公司；異丙胺，百靈威科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

勻質(zhì)機(jī)，上海茸研儀器有限公司；電子天平，永康市龍蓓工貿(mào)有限公司；XH-C漩渦混合器，金壇區(qū)金城海瀾儀器制造廠；TDL-5000-CR低速離心機(jī)，上海圣科儀器設(shè)備有限公司；微量移液器（單道20～200 μL、100～1 000 μL，多道20～300 μL），上海力辰儀器科技有限公司；SPX-250生化培養(yǎng)箱，上海合呈儀器制造有限公司；酶標(biāo)儀，北京線上生物科技有限公司；磁力攪拌器，鞏義予華儀器有限公司；溫度計(jì)、四口瓶、恒壓滴液漏斗、抽濾瓶、抽濾漏斗，上海禾汽玻璃儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 莠去津半抗原的合成

合成路線如圖1所示。在四口瓶中加入水、異丙胺，插入溫度計(jì)，冰水浴冷卻反應(yīng)混合物至0～5 ℃，緩慢滴加三聚氯氰，當(dāng)三聚氯氰剩下一半時(shí)開始滴加30%的氫氧化鈉水溶液，滴加的速度和滴加三聚氯氰的速度保持一致，直到所有原料全部滴加完成，保持0～5 ℃反應(yīng)40 min，反應(yīng)中，在另一個(gè)四口瓶中加入4-氨基丁酸和水，控制該溶液溫度在20～25 ℃，開始滴加反應(yīng)完全的異丙胺和三聚氯氰的反應(yīng)液，當(dāng)加入一半時(shí)，開始滴加30%氫氧化鈉水溶液，滴加的速度和反應(yīng)液滴加的速度保持一致，直到所有原料全部滴加完畢。保持溫度反應(yīng)40 min。反應(yīng)瓶底部產(chǎn)生大量白色固體，過(guò)濾該固體，洗滌至中性，空氣中干燥后，加入100 mL的正己烷中，攪拌過(guò)夜，次日進(jìn)行過(guò)濾，用正己烷沖洗濾餅3次，每次20 mL，得到的固體再空氣中干燥后即為目標(biāo)產(chǎn)物。各原料和三聚氯氰的摩爾比均為1∶1。

圖1 莠去津半抗原的合成路線圖

1.3.2 人工抗原的制備

（1）免疫的原制備。將45 mg莠去津半抗原溶于1 mL DMF中，加入70 mg NHS和70 mg EDC，室溫反應(yīng)30 min后，緩慢滴加4 mL BSA的PB溶液，滴畢，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。次日將反應(yīng)液離心，收集上清液。隨后用0.02 mol/L PB緩沖液將偶聯(lián)所得免疫原透析3天，每天早晚更換透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)。即得莠去津免疫原，分裝，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）莠去津包被原制備。稱取45 mg莠去津半抗原溶解于1 mL DMF溶液中，分別加入100 mg EDC和100 mg NHS活化，30 min后將其加入到150 mg載體蛋白OVA（溶于5 mL PB緩沖液中）室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。次日將反應(yīng)液離心，取上清液，4℃的條件下，用0.02 mol/L PB緩沖液透析3天，每天更換透析液兩次后分裝，-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 莠去津單克隆抗體制備

按照文獻(xiàn)的方法制備腹水單克隆抗體，每只小鼠的免疫劑量為200 μg?？贵w的純化采用飽和硫酸銨法。

1.3.4 抗原抗體最佳工作濃度的確定

將莠去津的包被抗原和單克隆抗體溶液進(jìn)行倍比稀釋，進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方陣試驗(yàn)，分別選取OD450最接近1.0的濃度作為最佳工作濃度。

1.3.5 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的建立

用相應(yīng)的抗原緩沖液將包被抗原稀釋成10 μg/mL，100 μL/孔包被在96孔酶標(biāo)板上，37 ℃避光孵育2 h；在4 ℃冰箱中保存過(guò)夜，次日棄去孔中包被液，用洗滌液洗滌1次，拍干，150 μL/孔加入封閉液，37℃保存2 h；直接拍干，加入一系列濃度呈現(xiàn)梯度的莠去津高標(biāo)溶液，50 μL/孔，加畢，加入經(jīng)抗體稀釋液稀釋成最佳工作濃度的抗體溶液，50 μL/孔，然后25 ℃避光反應(yīng)30 min；洗滌4～5次后，拍干，加入酶標(biāo)二抗，100 μL/孔，25 ℃避光反應(yīng)30 min后用洗滌液洗滌4～5次，拍干，先加入底物液A液（過(guò)氧化脲）再加入B液（四甲基聯(lián)苯胺），各50 μL/孔，25 ℃保存15 min后加入2 mol/L H2SO4水溶液，孔內(nèi)液體由藍(lán)色變成黃色，將酶標(biāo)儀設(shè)定波長(zhǎng)為450 nm，測(cè)定每孔吸光度值（OD值）。并用RIDASCREEN軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別選擇標(biāo)準(zhǔn)品濃度0、3、9、27、81 ng/mL和243 ng/mL，以濃度為0 ng/mL時(shí)的OD值為B0值，相應(yīng)莠去津濃度的OD值為B值，以百分吸光度值（B/B0）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，采用RIDASCREEN軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并打印成紙質(zhì)文檔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察。

1.3.7 甘蔗和玉米的樣本前處理

用10 mL的離心管稱取勻質(zhì)后的玉米和甘蔗樣品，玉米和甘蔗分別稱取兩管，每一管中樣品的質(zhì)量為1 g，然后將其中一管玉米樣品和一管甘蔗樣品進(jìn)行加標(biāo)，加標(biāo)量為10 μg，然后每一管中加入2 mL甲醇，用渦旋儀渦動(dòng)1 min將樣品混勻；室溫4 500 r/min離心5 min后取上清液200μL，加入到含有800 μL復(fù)溶液的樣品管中混勻進(jìn)行用于ELISA分析。確定甲醇作為提取劑的提取效果。

1.3.8 確立試劑盒各項(xiàng)技術(shù)參數(shù)

（1）試劑盒檢測(cè)限確立試驗(yàn)。用20個(gè)空白樣本通過(guò)試劑盒測(cè)定的光密度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)的莠去津濃度的平均值（X）和標(biāo)準(zhǔn)差（S）來(lái)表示為MDL=X+3S。

（2）試劑盒準(zhǔn)確度和精密度確立試驗(yàn)。分別用5、10、15μg/kg三個(gè)不同濃度的莠去津標(biāo)準(zhǔn)品作空白玉米和甘蔗樣本的添加回收試驗(yàn)，計(jì)算其回收率和變異系數(shù)，分別表示如下：

式中，Cx為添加了一定莠去津含量的樣本經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線分析得到的實(shí)際濃度，μg/kg；C0為空白樣本經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線分析得到的實(shí)際濃度，μg/kg；C為實(shí)際添加的莠去津濃度，μg/kg。

（3）試劑盒穩(wěn)定性試驗(yàn)。將一定量的試劑盒保存于4℃環(huán)境中，每隔1個(gè)月取出適量，分別測(cè)定其空白標(biāo)準(zhǔn)品的OD值、IC50，及按上述方法進(jìn)行添加回收試驗(yàn)所測(cè)得的回收率以及變異系數(shù)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果判斷試劑盒的穩(wěn)定性；考慮到試劑盒在運(yùn)輸和使用過(guò)程中可能會(huì)有非正常保存條件出現(xiàn)，將試劑盒保存在37 ℃條件下，每隔1天取出進(jìn)行測(cè)定，直到試劑盒的靈敏度和回收率開始下降為止停止檢測(cè)。一般情況下，在37℃穩(wěn)定1天，相當(dāng)于4～10 ℃保存45天。由此確定其保質(zhì)期。

（4）可靠性試驗(yàn)。各隨機(jī)抽取玉米和甘蔗樣品20份，用本試劑盒方法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中標(biāo)準(zhǔn)方法中氣相色譜法（對(duì)水果、蔬菜、谷物中莠去津的最低檢測(cè)濃度為4 μg/kg）分別對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)兩種檢測(cè)方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，驗(yàn)證試劑盒檢測(cè)實(shí)際樣本的準(zhǔn)確度。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳工作濃度的選擇

運(yùn)用方陣法測(cè)定不同包被原和單克隆抗體的間接競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA測(cè)定結(jié)果（OD450值），見表1。在ELISA包被過(guò)程中，包被效果與濃度呈正相關(guān)，但濃度過(guò)高，會(huì)降低待測(cè)物的競(jìng)爭(zhēng)能力，從而降低曲線靈敏度。因?yàn)槊笜?biāo)儀測(cè)定OD450值的敏感范圍在1.00左右，為了保證測(cè)定結(jié)果的靈敏可靠，根據(jù)表中的結(jié)果，確定實(shí)驗(yàn)的最適包被原稀釋倍數(shù)為13.5×104，最佳抗體稀釋倍數(shù)為1∶125 000。

表1 不同包被原和單克隆抗體稀釋濃度的OD450值表

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

根據(jù)建立的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，將莠去津標(biāo)準(zhǔn)品濃度稀釋為0、3、9、27、81 ng/mL和243 ng/mL，用上文所確定的抗體稀釋倍數(shù)稀釋抗體，用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，其中0和3 ng/mL點(diǎn)雙孔，其余的濃度點(diǎn)單孔，采用二步法進(jìn)行檢測(cè)，得出相關(guān)系數(shù) R2=0.9955，IC50為18 μg/L。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。

圖2 莠去津的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.3 試劑盒各項(xiàng)技術(shù)參數(shù)的確定

2.3.1 試劑盒檢測(cè)限試驗(yàn)

由表2可知，該試劑盒方法對(duì)玉米和甘蔗樣本的檢測(cè)下限分別為 24.60 μg/kg、26.30 μg/kg。

表2 莠去津試劑盒方法檢測(cè)限表

2.3.2 準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)

分別以回收率和變異系數(shù)表示試劑盒測(cè)定的準(zhǔn)確度以及檢測(cè)精密度。分別設(shè)置空白玉米和甘蔗樣本，以50、100、150μg/kg 3個(gè)添加濃度做添加回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度做4個(gè)平行，用3個(gè)批次的試劑盒進(jìn)行測(cè)定，分別計(jì)算回收率和批內(nèi)、批間變異系數(shù)，結(jié)果見表3。

表3 莠去津試劑盒的準(zhǔn)確度和精密度表

由表3可知，以3個(gè)不同濃度的莠去津標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)空白玉米和甘蔗樣本進(jìn)行添加時(shí)，其加標(biāo)回收率范圍為88.5%～106.4%，批內(nèi)變異系數(shù)范圍為5.0%～7.3%，批間變異系數(shù)范圍為6.9%～8.8%，均小于10%，以上結(jié)果說(shuō)明，該試劑盒的各項(xiàng)參數(shù)均符合要求。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

試劑盒在2～8 ℃的保存條件下，經(jīng)過(guò)12個(gè)月的測(cè)定，其最大吸光度值（零標(biāo)準(zhǔn)）、抑制中濃度、莠去津添加回收實(shí)驗(yàn)測(cè)定值均在正常范圍之內(nèi)。在各種非正常保存條件中，測(cè)定結(jié)果也沒(méi)有異常。從以上可知試劑盒可以在2～8 ℃至少保存12個(gè)月以上。

2.3.4 可靠性試驗(yàn)

通過(guò)ELISA試劑盒法和氣相色譜法對(duì)隨機(jī)抽取的玉米、甘蔗樣本進(jìn)行測(cè)定。玉米和甘蔗樣本的陽(yáng)性判定線為27 μg/kg，結(jié)果篩選出1份陽(yáng)性玉米樣本和3份陽(yáng)性甘蔗樣本，兩種方法的比較結(jié)果見表4。

表4 ELISA法和GC法檢測(cè)結(jié)果比較表

由表4可知，用ELISA法和GC法的測(cè)定結(jié)果基本一致，適用于玉米和甘蔗中莠去津殘留的篩選。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)全合成法制備出莠去津小分子半抗原，該半抗原與載體蛋白偶聯(lián)合成的人工抗原經(jīng)動(dòng)物免疫獲得單克隆抗體。經(jīng)篩選純化后，初步建立了莠去津酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)方法。該方法的靈敏度為3 μg/L，對(duì)玉米和甘蔗樣本的最低檢測(cè)限為27 μg/kg，樣本添加回收率范圍為88.5%～106.4%，批間/批內(nèi)變異系數(shù)為均低于10%。本研究所得結(jié)果在其檢測(cè)限范圍內(nèi)，因此可用于相關(guān)行業(yè)的莠去津殘留快速檢測(cè)。此外，本實(shí)驗(yàn)所研制的試劑盒的使用可最大限度地節(jié)約時(shí)間成本和經(jīng)濟(jì)成本，對(duì)檢測(cè)人員的要求較低，適用于大量樣本中莠去津殘留量檢測(cè)的快速篩選，可更好地應(yīng)用于我國(guó)基層檢測(cè)單位、政府職能監(jiān)管部門等開展的檢測(cè)工作，是一種可靠的莠去津農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)方法。

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