TWEAK-Fn14軸相關(guān)因子在皮肌炎患者中的表達(dá)

童 芳,夏育民,王 萍

(1.皖南醫(yī)學(xué)院 微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室,安徽 蕪湖 241002；2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院 皮膚與性病科，陜西

皮肌炎(Dermatomyositis，DM)是一種特發(fā)性炎癥性肌病，以炎性浸潤為主，主要影響骨骼肌和皮膚。皮膚病理表現(xiàn)為表皮萎縮、基底膜變性真皮間質(zhì)黏蛋白沉積[1]。肌肉活檢呈現(xiàn)Ⅱ型肌纖維萎縮、壞死和肌核膜集中肥大等特征性變化[2]。DM是一種少見病，影響兒童和成人，男女比例約為2∶1，目前病理機(jī)制尚不清楚[3]。

腫瘤壞死因子樣弱凋亡誘導(dǎo)因子(TNF-related weak inducer of apoptosis，TWEAK)和成纖維細(xì)胞生長誘導(dǎo)因子14(fibroblast growth factor-inducible 14，F(xiàn)n14),在組織損傷和患有疾病時有所增加[4]。兩者結(jié)合后在TNF受體相關(guān)因子(TRAF)協(xié)同作用下激活下游信號通路,上調(diào)一系列促炎因子，如調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌的活性因子(regulated upon activation normal T cell expressed and secreted，RANTES)、γ-干擾素誘導(dǎo)蛋白10(interferon gamma-induced protein 10，IP-10)和單核細(xì)胞趨化蛋白(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)[5-6]，趨化巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等參與局部的炎癥反應(yīng)。迄今為止，有關(guān)TWEAK-Fn14在DM中表達(dá)的報道非常有限。Ro52是一個52 ku的胞內(nèi)蛋白,與光敏性有關(guān)，在一些炎癥性皮膚病的表皮中高表達(dá)。但皮肌炎中Ro52是否表達(dá)鮮有報道。

1 材料及方法

1.1 材料 選取西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚科病理室2012年1月～2016年9月皮肌炎石蠟標(biāo)本，其中包括皮膚組織10例，男性1例，女性9例，年齡19～73歲，平均年齡(50.4±14.04)歲；肌肉組織5例，年齡39～69歲，平均年齡(54.2±11.45)歲。另選用整形手術(shù)切除的正常皮膚組織和骨外傷患者的正常肌肉組織作為對照，其中包括皮膚組織6例，年齡25～51歲，平均年齡(38.6±11.01)歲；肌肉組織5例，年齡37～64歲，平均年齡(51.6±11.97)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批，所有標(biāo)本取材均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑及配制 兔抗人TWEAK多克隆IgG購自美國Santa公司。Anti-TWEAKER IgG、Anti-RANTES IgG、Anti-MCP-1 IgG、Anti-IP-10 IgG均為美國Abcam公司產(chǎn)品。兔抗人Ro52多克隆抗體為美國Santa公司產(chǎn)品。兔/鼠通用型Streptavidin-HRP試劑盒(內(nèi)含內(nèi)源限速酶封閉緩沖液、山羊血清封閉液、DAB)購自中國康為世紀(jì)公司。HRP標(biāo)記的兔/鼠通用型二抗購自丹麥Dako公司。Mayer改良蘇木素購自中國Heart公司。中性樹膠購自中國上海。

抗原修復(fù)液：檸檬酸10 mmol/L，EDTA-Na21 mmol/L，Tween-20 500 μL，調(diào)節(jié)pH至6.0，加蒸餾水定容至1000 mL；組織通透液0.1% Triton-100∶1 mL Triton-100加入1000 mL PBS緩沖液中，使其充分溶解；0.1% PBST：1 mL Tween-20 加入1000 mL PBS緩沖液中，使其充分溶解。

1.3 主要儀器 石蠟切片機(jī)、烤片機(jī)均為德國Leica公司產(chǎn)品；正置顯微鏡為日本尼康株式會社生產(chǎn)。

1.4 實驗方法

1.4.1 石蠟切片的制備 手術(shù)標(biāo)本用生理鹽水徹底沖洗，經(jīng)4%多聚甲醛固定,梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。每個標(biāo)本取13張，其中1張用于常規(guī)HE染色，其余行免疫組織化學(xué)染色。

1.4.2 免疫組化染色采用SP法 切片常規(guī)脫蠟，抗原修復(fù)，3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，用正常山羊血清封閉，滴加一抗(4 mg/L，用封閉液稀釋，PBS替代一抗作為陰性對照)和適量HRP-標(biāo)記的兔鼠通用型二抗(PBS替代二抗作為陰性對照)，DAB顯色，蘇木精輕度復(fù)染，然后脫水，透明，中性樹膠封片，用光學(xué)顯微鏡觀察并攝片。

1.4.3 結(jié)果判定和圖像分析 用Image-ProPlus軟件測定某一視野下陽性染色細(xì)胞的光密度(optical density，OD),每張切片隨機(jī)選取10個視野,對每組樣本陽性染色細(xì)胞的OD值取平均值,進(jìn)行表達(dá)情況分析。

2 結(jié)果

切片經(jīng)染色后，TWEAK、Fn14、MCP-1、RANTES、IP-10和Ro52陽性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)/膜呈淡黃色、黃色或黃褐色，細(xì)胞核不著色。我們采用免疫組化的方法檢測TWEAK、Fn14、MCP-1、RANTES、IP-10、Ro52在DM患者皮膚組織和正常皮膚組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示各蛋白在DM皮膚中表達(dá)較健康組織升高(圖1a、b)。DM皮膚組織各蛋白的平均光密度值較健康皮膚組織增高(表1、 圖1c)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 DM患者和健康對照組皮膚中各蛋白平均光密度值

DM組(n=10)健康對照組(n=6)tPTWEAK0.113±0.0400.023±0.0036.9090.000Fn140.034±0.0260.010±0.0042.8110.010MCP-10.195±0.0680.059±0.0255.7540.000RANTES0.097±0.0290.039±0.0224.1720.001IP-100.129±0.0680.043±0.0272.9260.006Ro520.125±0.0620.029±0.0043.6950.001

用同樣方法檢測各蛋白在DM患者肌肉組織和正常肌肉組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示在DM肌肉組織中各蛋白的表達(dá)較健康肌肉組織升高(圖2a、b)。DM肌肉組織各蛋白的平均光密度值較健康肌肉組織增高(表2、 圖2c)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 DM患者和健康對照組肌肉中各蛋白平均光密度值

DM組(n=5)健康對照組(n=5)tPTWEAK0.015±0.0161.515±2.355*2.1610.049Fn140.035±0.0180.004±0.0033.7100.003MCP-10.094±0.0380.044±0.0302.2970.026RAN-TES0.071±0.0320.008±0.0054.4140.001IP-100.083±0.0560.029±0.0092.0980.035Ro520.018±0.0080.004±0.0053.3970.005

注：*(×10-5)。

A.TWEAK、Fn14、MCP-1在DM患者和健康對照組皮膚中的表達(dá)；B.RANTES、IP-10、Ro52在DM患者和健康對照組皮膚中的表達(dá)；C.DM患者和健康對照組皮膚組織各蛋白的平均光密度值。免疫組織化學(xué)染色×200。1.TWEAK;2.Fn14;3.MCP-1;4.RANTES;5.IP-10；6.Ro52，*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001。

圖1 TWEAK、Fn14、MCP-1、RANTES、IP-10、Ro52在DM患者和健康對照組皮膚中的表達(dá)

A.TWEAK、Fn14、MCP-1在DM患者和健康對照組肌肉中的表達(dá)；B.RANTES、IP-10、Ro52在DM患者和健康對照組肌肉中的表達(dá)；C.DM患者和健康對照組肌肉組織各蛋白的平均光密度值。免疫組織化學(xué)染色 ×200。1.TWEAK;2.Fn14;3.MCP-1;4.RANTES;5.IP-10；6.Ro52，*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001。

圖2 DM患者和健康對照組肌肉組織中各蛋白的表達(dá)

3 討論

TWEAK屬于TNF超家族多功能細(xì)胞因子，通過結(jié)合并激活細(xì)胞上的受體Fn14發(fā)揮作用,Fn14為TNF受體超家族(TNFRSF)蛋白[7]。TWEAK最初被合成為Ⅱ型跨膜蛋白，但它在細(xì)胞內(nèi)可被弗林蛋白酶裂解，釋放出可溶性的細(xì)胞因子，以自分泌或旁分泌的方式作用于細(xì)胞[8]。Fn14是Ⅰ型跨膜蛋白，可高度誘導(dǎo)多種生長因子,包括表皮生長因子(EGF)、血小板源性生長因子(PDGF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。

Zhao等[9]發(fā)現(xiàn)TWEAK可導(dǎo)致小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，而MRL/lpr Fn14基因敲除小鼠的皮膚病變明顯減輕，T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤減少，說明TWEAK-Fn14軸有助于皮膚型紅斑狼瘡(CLE)的發(fā)病。TWEAK是一種炎性細(xì)胞因子，有力地調(diào)節(jié)著神經(jīng)損傷引起的骨骼肌萎縮。TWEAK及其受體Fn14，是骨骼肌質(zhì)量的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[10]。Enwere等證明高濃度的TWEAK可通過激活NF-κB通路損害肌肉[11]。Mittal等說明TWEAK-Fn14軸可能會損害骨骼肌的形成，有助于肌肉萎縮[12]。也有實驗在皮肌炎(DM)和多發(fā)性肌炎(PM)患者肌肉組織中檢測出高水平的TWEAK和Fn14，且Fn14的表達(dá)與肌肉疾病活動度呈正相關(guān)，同時還發(fā)現(xiàn)TWEAK蛋白在局部白細(xì)胞浸潤的地方表達(dá)增加，F(xiàn)n14 mRNA和蛋白在肌纖維膜上表達(dá)上調(diào)，于是提出TWEAK-Fn14信號在PM/DM的發(fā)病機(jī)制中可能起重要作用[13]。這與我們的研究結(jié)果一致。我們運用免疫組織化學(xué)研究了皮肌炎肌肉組織與皮膚中的TWEAK、Fn14及下游因子MCP-1、RANTES和IP-10水平，各蛋白呈陽性表達(dá)或呈強(qiáng)陽性表達(dá)；在正常組織中，TWEAK、Fn14表達(dá)較弱或幾乎不表達(dá)。在皮膚組織中，6種蛋白主要分布在表皮中，在真皮部位炎性細(xì)胞浸潤的地方表達(dá)明顯；肌肉組織中各蛋白表達(dá)的分布，尚未呈現(xiàn)一定的規(guī)律。

Ro52是一種廣泛表達(dá)的干擾素誘導(dǎo)蛋白[14]，可被干擾素或干擾素誘導(dǎo)劑如病毒感染或Toll樣受體所誘導(dǎo)上調(diào)。尤其是中波紫外線(波長290～320 nm)，又稱為中波紅斑效應(yīng)紫外線，可誘發(fā)皮膚的損傷，繼而激活免疫系統(tǒng)，上調(diào)光敏相關(guān)蛋白Ro52的表達(dá)，誘導(dǎo)Ro52-抗Ro52免疫復(fù)合物的形成，最終促使皮膚光敏的發(fā)生?？筊o52抗體可篩選系統(tǒng)性自身免疫性病，如SLE、CLE、干燥綜合征、系統(tǒng)性硬化、皮肌炎/多發(fā)性肌炎、混合結(jié)締組織病以及RA等。大量報道顯示抗Ro52抗體和Ro52與CLE的光敏性狼瘡密切相關(guān)[15-16]。在紫外線誘導(dǎo)的或自發(fā)的CLE損傷，以及在其他炎癥皮膚中，Ro52的表達(dá)與健康組織相比呈增高趨勢[17]。Liu等[18]發(fā)現(xiàn)Ro52在表達(dá)著TWEAK和Fn14的CLE皮損區(qū)高表達(dá)，此外TWEAK在培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞中可單獨上調(diào)Ro52的表達(dá)，證明了TWEAK/Fn14調(diào)控Ro52的表達(dá)及其他下游信號。這些研究大多針對皮膚組織，對于自身免疫病肌肉組織是否表達(dá)Ro52的研究較少。有關(guān)于TWEAK和Ro52在皮肌炎中同時表達(dá)的研究尚未報道。在研究中我們用免疫組化法同時觀察了皮膚和肌肉組織與抗Ro52抗體的結(jié)合情況，發(fā)現(xiàn)Ro52不僅在DM的皮膚組織中表達(dá)，在肌肉組織也高表達(dá)。TWEAK與Fn14結(jié)合后,可以激活核因子-κB(NF-κB)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt途徑，從而上調(diào)Ro52和一些因子的表達(dá)，這些因子包括MCP-1、RANTES、IP-10，可以招募巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，浸潤的免疫細(xì)胞又可以分泌促炎癥因子，如TWEAK和干擾素α，從而加重了皮肌炎的免疫反應(yīng)。

總之，在皮肌炎發(fā)病機(jī)制中，TWEAK-Fn14通路很可能起著重要作用，該通路在DM中很可能被激活。為了進(jìn)一步驗證TWEAK-Fn14信號在皮肌炎皮膚和肌肉中被激活，我們后續(xù)研究除了測定血清中TWEAK、Fn14及下游因子水平，還需測定皮膚和肌肉組織中相關(guān)mRNA表達(dá)量，以及分析TWEAK、Fn14與疾病嚴(yán)重程度是否存在聯(lián)系。

【參考文獻(xiàn)】

[1] BOLOGNIA JL,JORIZZO JL,SCHAFFER JV,etal.Dermatology[M].3rd ed.London:ELSEVIER,2012:1875-1876.

[2] SCHWARZ HA,SLAVIN G,WARD P,etal.Muscle biopsy in polymyositis and dermatomyositis:a clinicopathological study[J].Annals of the Rheumatic Diseases,1980,39(5):500-507.

[3] RAVAVARAPU S,COLEY W,NAGARAJU K.An update on pathogenic mechanisms of inflammatory myopathies [J].Current Opinion in Rheumatology,2011,23(6):579-584.

[4] BURKLY LC,MICHAELSON JS,HAHM K,etal.TWEAKing tissue remodeling by a muLtifunctional cytokine:Role of TWEAK/Fn14 pathway in health and disease [J].Cytokine,2007,40(1):1-16.

[5] DOERNER JL,WEN J,XIA Y,etal.TWEAK/Fn14 signaling involvement in the pathogenesis of cutaneous disease in the MRL/lpr model of spontaneous lupus [J].Journal of Investigative Dermatology,2015,135(8):1986-1995.

[6] CHEN J,WEI L,XIA Y.Roles of tumour necrosis factor-related weak inducer of apoptosis/fibroblast growth factor-inducible 14 pathway in lupus nephritis [J].Nephrology,2017,22(2):101-106.

[7] WINKLES JA.The TWEAK-Fn14 cytokine-receptor axis:discovery,biology and therapeutic targeting [J].Nature Reviews Drug Discovery,2008,7(5):411-425.

[8] CHICHEPORTICHE Y,BOURDON PR,XU H,etal.TWEAK,a new secreted ligand in the tumor necrosis factor family that weakly induces apoptosis [J].Journal of Biological Chemistry,1997,272(51):32401-32410.

[9] ZHAO Z,BURKLY LC,CAMPBELL S,etal.TWEAK/Fn14 interactions are instrumental in the pathogenesis of nephritis in the chronic graft-versus-host model of systemic lupus erythematosus[J].Journal of Immunology,2007,179(11):7949 -7958.

[10] DOGRA C,CHANGOTRA H,WEDHAS N,etal.TNF-related weak inducer of apoptosis (TWEAK) is a potent skeletal muscle-wasting cytokine [J].FASEB J,2007,21(8):1857-1869.

[11] ENWARE EK,HOLBROOK J,LEIMI-MRAD R,etal.TWEAK and cIAP1 reguLate myoblast fusion through the noncanonical NF-κB signaling pathway[J].Sci Signal,2012,5(246):ra75.

[12] MITTAL A,BHATNAGAR S,KUMAR A,etal.The TWEAK-Fn14 system is a critical reguLator of denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice [J].Journal of Cell Biology,2010,188(6):833-849.

[13] PENG QL,SHU XM,TIAN XL,etal.Expression of tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis and fibroblast growth factor-inducible 14 in patients with polymyositis and dermatomyositis [J].Arthritis Res Ther,2014,16:R26.

[14] REYMOND A,MERONI G,FANTOZZI A,etal.The tripartite motif family identifies cell compartments[J].EMBO J,2001,20(9):2140-2151.

[15] MEIER HC,SANDLER DP,SIMONSICK EM,etal.Association between vitamin D deficiency and antinuclear antibodies in middle-aged and older U.S.aduLts [J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2016,25(12):1559-1563.

[16] WOLLINA U,HANSEL G.The use of topical calcineurin inhibitors in lupus erythematosus:an overview [J].J Eur Acad Dermatol Venereol,2008,22(1):1-6.

[17] OKE V,VASSILAKI I,ESPINOSA A,etal.High Ro52 expression in spontaneous and UV-induced cutaneous inflammation [J].Journal of Investigative Dermatology,2009,129(8):2000-2010.

[18] LIU Y,XU M,MIN X,etal.TWEAK/Fn14 activation participates in Ro52-mediated photosensitization in cutaneous lupus erythematosus [J].Frontiers in Immunology,2017,8:651.