尹祥佳　郝楠　南銘　李世風(fēng)　李艷玫　賈國軍

摘要：從玉米基因組DNA提取、引物的篩選、PCR反應(yīng)體系優(yōu)化、部分推廣玉米品種純度鑒定引物信息等方面綜述了SSR分子標記在玉米雜交種純度鑒定方面的研究及應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：SSR；玉米；純度鑒定；研究及應(yīng)用

中圖分類號：S513 文獻標志碼：A 文章編號：1001-1463（2018）11-0097-06

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2018.11.027

Research and Application of SSR Molecular Markers to Identify Purity of Corn Hybrid

YIN Xiangjia1， HAO Nan1， NAN Ming 2， LI Shifeng 3， LI Yanmei 1， JIA Guojun 1

（1. Lanzhou Vocational and Technical College， Lanzhou Gansu 730070， China； 2.Dingxi Academy of Agricultural Sciences， Dingxi Gansu 743000， China； 3.Gansu Dunhuang Seed Co.， Ltd.， Jiuquan Gansu 735000， China）

Abstract：In this paper， the research and application of SSR molecular markers in the purity identification of corn hybrids were reviewed from the aspects of genomic DNA extraction， primer screening， PCR reaction system optimization and primer information for purity identification of some corn cultivars.

Key words：SSR； Corn； Purity identification； Research and application

玉米是重要的糧食、飼料和工業(yè)原料作物，也是我國種植面積和產(chǎn)量最大的作物[1 - 4 ]。據(jù)國家統(tǒng)計局2017年糧食產(chǎn)量公告[5 ]，在2017年國家繼續(xù)采取調(diào)整農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)，加快優(yōu)化區(qū)域布局，特別是大幅度調(diào)減“鐮刀彎”地區(qū)玉米播種面積的大背景下，全國糧食播種面積為1.122億hm2，谷物播種面積0.929億hm2，玉米播種面積為0.355億hm2，占谷物播種面積的38.21%，占糧食播種面積的31.64%。2017年全國糧食總產(chǎn)量 6 179億kg，玉米總產(chǎn)量2159億kg，占糧食總產(chǎn)量的34.94%。作為我國第一大作物的玉米在保障國家糧食生產(chǎn)和安全中具有舉足輕重的地位[6 ]。2016年新實施的《種子法》在原有國審和省（區(qū)）玉米品種審定制度的基礎(chǔ)上增加了綠色通道、聯(lián)合試驗體以及引種備案制等，簡化了玉米品種審定程序，縮短了審定時間。玉米品種是決定玉米產(chǎn)量和品質(zhì)的決定因素。根據(jù)農(nóng)業(yè)部種子管理局中國種業(yè)大數(shù)據(jù)平臺顯示，截至2017年，我國已有審定玉米品種8 972個，其中國審品種588個，主要集中在科研院所和種業(yè)公司[7 ]。目前我國種子企業(yè)為4 660家，注冊資本在1億元以上的種業(yè)企業(yè)有200多家，前50強種子企業(yè)的銷售額達到219億元，集中度為35.54%[8 ]，由此可見，玉米是我國種業(yè)市場份額占比較大的作物。

隨著我國玉米種業(yè)市場化程度日益提高，純度鑒定成為種子質(zhì)量檢測的核心指標。種子純度是衡量種子質(zhì)量的一項重要指標，對玉米產(chǎn)量及品質(zhì)具有直接的影響。玉米種子純度受制種基地隔離標準實施的差異性，制種過程中的去雜、去雄的及時性與徹底性，制種農(nóng)戶對技術(shù)規(guī)程的執(zhí)行程度等綜合因素的共同影響[9 ]。甘肅省已形成以河西走廊為主、以沿黃灌區(qū)和隴南為補充的全國規(guī)模最大、最具有競爭力的玉米制種基地，雜交玉米制種產(chǎn)量占到全國玉米制種量的60%以 上[10 ]。因此，如何快速、有效地鑒別雙親、混雜品種和真實雜交種成為品種純度鑒定的關(guān)鍵[11 ]。分子標記是以DNA多態(tài)性為基礎(chǔ)的一類遺傳標記，較形態(tài)標記和生化標記具有遺傳穩(wěn)定好、多態(tài)性高、標記遍布整個基因組、無組織特異性而且不受外界自然環(huán)境影響等優(yōu)點，在玉米基因精細定位、遺傳多樣性分析、劃分雜種優(yōu)勢類群、分子標記輔助育種、指紋圖譜構(gòu)建、玉米種子純度鑒定等方面都有研究和應(yīng)用[12 ]。分子標記主要有限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）、隨機擴增多態(tài)性（RAPD）、擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）、單核苷酸多態(tài)性（SNP）、以及基于特定引物PCR的簡單序列重復(fù)（SSR）、序列特異擴增區(qū)域（SCAR）、相關(guān)序列擴增多態(tài)性（SRAP）、靶位區(qū)域擴增多態(tài)性（TRAP）等方法[13 - 14 ]。

隨著SSR分子標記技術(shù)的深入研究和發(fā)展，其在玉米育種及品種純度鑒定方面發(fā)揮著重要的作用。SSR分子標記一般由1～6個核苷酸為重復(fù)單位組成的長達幾十個核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列，具有遺傳多態(tài)性高、操作相對簡單、重復(fù)性好、成本較低等優(yōu)點，在玉米品種純度鑒定方面有著廣泛的應(yīng)用[15 ]。農(nóng)業(yè)部公布的玉米品種鑒定行業(yè)標準《玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標記法》（NY/T1432 — 2014）使SSR標記技術(shù)對玉米品種純度鑒定的方法更加完善和準確[16 - 17 ]。我們從玉米基因組DNA提取、引物的篩選、PCR反應(yīng)體系優(yōu)化、部分推廣玉米品種純度鑒定引物信息等方面綜述了SSR分子標記在玉米雜交種純度鑒定方面的研究及應(yīng)用。

1 DNA提取方法

DNA提取是SSR分子標記最基本的步驟，提取DNA的質(zhì)量要滿足PCR擴增反應(yīng)要求， DNA的提取方法主要有SDS法、CTAB法、堿裂解法和磁珠法。

1.1 SDS法

SDS（十二烷基硫酸鈉）是一種已知的能使蛋白質(zhì)變性的去污劑，在核酸抽提中可破壞細胞壁及裂解核酸，在較高溫度下破壞蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合，使DNA釋放出來。SDS法提取DNA選用的玉米材料有單粒干種子胚、葉片。高文偉等[18 ]用SDS法優(yōu)化建立了玉米單粒種子胚和葉片DNA快速提取方法。李蔥蔥等[19 ]用SDS法借助高通量組織研磨儀建立了用于玉米葉片基因組DNA的微量快速提取方法，用高通量組織研磨儀快速研磨液氮處理過的葉片，實現(xiàn)了高通量提取基因組DNA的目的，提高了DNA提取的效率。

1.2 CTAB法

CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）是一種陽離子去污劑，具有從低離子強度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。在高離子強度的溶液中，CTAB提取液與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，除去蛋白質(zhì)、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入冰乙醇沉淀即可使DNA分離出來。CTAB法選用的提取玉米材料有干種子、單粒干種子胚、發(fā)芽的種子幼苗、葉片。董永軍等[20 ]采用改良CTAB法，直接用全自動樣品快速研磨儀研磨玉米干種子來提取DNA。李藝等[21 ]將干種子水浴后取出胚研磨后加入CTAB提取液提取DNA。李汝玉等[22 ]用改良的CTAB提取法分別從粉碎的干種子和發(fā)芽4 d的種子幼苗中提取DNA。戴軍等[23 ]研究了兩步CTAB法提取玉米基因組DNA作為PCR反應(yīng)模版。王芳等[24 - 25 ]采用改良的CTAB法，以發(fā)芽的種子幼苗為材料提取玉米基因組DNA。由此可見，CTAB法是目前提取玉米基因組DNA比較常用和成熟的方法，再借助高通量組織研磨儀可以實現(xiàn)高通量的DNA提取，為玉米分子檢測提供了有效的基礎(chǔ)。

1.3 堿裂解法

堿裂解法主要用于單粒種子胚和幼芽的DNA提取，具有提取速度快，高通量的優(yōu)點[26 ]。郭景倫等[27 - 28 ]分別從干種子的胚和玉米幼芽中用堿裂解法提取DNA，直接用沸水加熱后加入TE緩沖液用于PCR擴增。吳向遠等[29 ] 采用堿裂解法從玉米單子粒胚中快速提取了基因組DNA。閆米格 等[30 ]將干種子胚放入96 孔深孔板中，用0.1 MNaOH來提取DNA。但堿裂解法在試驗過程中存在重復(fù)性和與引物的匹配性不高的情況，在引物篩選和建立PCR反應(yīng)體系方面還存在一定的局限性，影響一些玉米品種純度鑒定結(jié)果。

1.4 磁珠法

磁珠法是利用超順磁微球顆粒表面修飾一些活性官能團，使其與核酸分子結(jié)合，在磁場作用下，可以將帶有DNA分子的磁珠與溶液分離，之后通過漂洗過程除去雜質(zhì)，再用TE緩沖液或者雙蒸水洗脫吸附在磁珠顆粒表面的DNA。磁珠法提取玉米基因組DNA 時需要注意要提前30 min將試劑盒中保存于2～8 ℃的磁珠和洗滌液平衡至室溫，將裂解液置于50 ℃水浴中溶解并搖勻。徐 潮[31 ]研究建立了磁珠法快速提取玉米基因組DNA的方法，用3種便攜式提取裝置替代了傳統(tǒng)的實驗室儀器。陳麗麗等[32 ]的研究結(jié)果表明，磁珠法提取玉米基因組DNA的得率最高，時間最短。此外，磁珠法提取DNA的量多，操作簡便，整個提取過程可以在96孔深孔板中進行，常選用志昂生物科技有限公司普通植物DNA磁珠法提取試劑盒，借助自動提取儀器，編輯程序，實現(xiàn)自動化提取，但磁珠法存在DNA提取成本較高的問題。

綜上所述，在玉米基因組DNA提取過程中以上4種常用方法都在使用，但是為了滿足高通量的鑒定要求，大部分實驗室使用高通量的組織研磨儀來代替手工研磨，以降低工作量，提高效率。采用改良的SDS法和CTAB法，選用干種子或者干種子的胚，減少提取試劑的使用量和提取步驟，也取得了良好的效果。采用堿裂解法提取玉米干種子胚DNA，既節(jié)省了發(fā)芽時間和繁瑣的DNA提取時間，具有簡單、快速、易操作等優(yōu)點，提取的DNA質(zhì)量可以滿足PCR 擴增的需要。但是為了試驗的準確性和重復(fù)性，同時考慮試驗成本的因素，建議選用CTAB法來提取玉米基因組DNA。

2 引物的篩選

近些年玉米基因組學(xué)和生物信息學(xué)的研究與發(fā)展，為玉米SSR標記技術(shù)的廣泛應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)。Maize GDB（https：//www.maizegdb.org）中含有大量的SSR標記引物信息數(shù)據(jù)，可以直接查詢數(shù)據(jù)庫或者參考相關(guān)研究文獻，將現(xiàn)有的SSR標記引物用于玉米品種純度鑒定試驗。品種純度鑒定之前要根據(jù)具體的試驗玉米品種對引物進行篩選來確定最優(yōu)的SSR標記鑒定引物。王陸軍等[33 ]根據(jù)前期研究的成果確定了10對核心引物，并用核心引物對18份山西省主推玉米雜交種及其自交系進行了引物篩選，得出了多態(tài)性綜合表現(xiàn)最好的umc1590和umcl196等2對引物，可用于鑒定大部分品種的純度。王風(fēng)格等[34 ]用10對SSR引物將420份已知玉米雜交種進行DNA指紋分析，確定了bnlg161和bnlg1450等2對作為玉米雜交種純度鑒定的首選核心引物，bnlg439、bnlg125、umc2105、umcl705和bnlg1792等5對引物作為備選核心引物，可以鑒定出412個玉米品種的純度。由此可見，引物的篩選對檢測的結(jié)果有著決定性的影響，1對引物可以檢測多個品種，有時候也需要2對以上的引物來鑒定1個品種的純度，因此，建立玉米品種的引物信息共享數(shù)據(jù)庫具有重要意義。

3 PCR反應(yīng)優(yōu)化

在SSR分子標記鑒定玉米雜交種純度的試驗中，做好PCR反應(yīng)的優(yōu)化對檢測結(jié)果起著重要的作用。PCR反應(yīng)優(yōu)化有PCR反應(yīng)體系和PCR儀反應(yīng)條件的優(yōu)化兩個方面。PCR反應(yīng)體系針對玉米基因組DNA、引物、DNA聚合酶、dNTP等反應(yīng)物質(zhì)混合體積的組合。目前所需要的反應(yīng)試劑都可以向?qū)ｉT的生物技術(shù)公司購買直接使用，有些公司還提供DNA聚合酶、dNTP和buffer的混合PCR反應(yīng)試劑，使用的時候直接加入引物和雙蒸水，可以有效縮短樣品純度檢測時間。除此之外還要考慮在保證檢測結(jié)果質(zhì)量的基礎(chǔ)上適當?shù)臏p少反應(yīng)體系的總體積，這樣可以在一定程度上節(jié)約試驗成本。王士磊等[35 ]對玉米SSR-PCR體系從模板DNA、dNTP、引物、DNA聚合酶濃度4種因素4個水平進行優(yōu)化分析，并對退火溫度進行梯度試驗，建立了10 μL的高效、實用、穩(wěn)定的反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)優(yōu)化要建立在高度的可重性的基礎(chǔ)上，減少檢測試驗的成本，以最少的體系量和最佳的PCR反應(yīng)程序來得出準確的結(jié)果。

4 部分推廣玉米品種純度鑒定引物信息

現(xiàn)將文獻報道和在MaizeGDB中補充查詢到的部分推廣玉米品種的純度鑒定所需要SSR標記引物信息進行了匯總（表1）[36 - 51 ]，供相關(guān)領(lǐng)域的研究人員提供參考。

5 結(jié)束語

SSR分子標記應(yīng)用于鑒定玉米品種純度，大大縮短了種子純度的檢測時間，及時確定不同玉米品種種子質(zhì)量，防止不合格種子播種，對保護農(nóng)戶種植利益、玉米生產(chǎn)安全，促進農(nóng)業(yè)發(fā)展和農(nóng)村社會穩(wěn)定起到了積極的促進作用。主要表現(xiàn)在以下三個層面。第一個層面是玉米種業(yè)企業(yè)可以利用SSR分子標記技術(shù)準確快速檢測玉米種子的純度，保證種子的真實性，這樣可以建立起玉米種業(yè)企業(yè)的制種質(zhì)量監(jiān)控體系，有效促進玉米田間制種技術(shù)規(guī)程的使用效果，嚴格做好去雜和去雄的工作。SSR標記可以非常有效地將品種親本自交系進行區(qū)別，為了提高檢測結(jié)果的準確性，還可以通過多對標記引物逐一對同一樣品進行鑒定，或者利用多重PCR將多對引物混合起來進行純度鑒定。第二個層面主要是國家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物新品種保護辦公室在受理玉米新品種保護時，利用SSR分子標記技術(shù)做好DUS測試的部分內(nèi)容，給申請品種一個身份權(quán)利保護標識，防止該玉米品種被其他品種冒充，對玉米新品種加強保護的效力。第三個層面是每年各級種子管理部門的春季種子市場執(zhí)法檢查，其中主要是對品種的真實性和種子純度進行檢查和檢測，以此來保護農(nóng)戶的合法權(quán)益，維護玉米生產(chǎn)安全。

隨著SSR分子標記技術(shù)與信息技術(shù)的結(jié)合，如何有效建立快速鑒定農(nóng)作物品種純度和真實性的方法，使得玉米品種純度的鑒定可以在植株任何生長階段都能快速進行成為了新的研究課題。同時還要利用互聯(lián)網(wǎng)技術(shù)，在國家主管部門的指導(dǎo)下，實現(xiàn)試驗數(shù)據(jù)在不同實驗室和不同企事業(yè)單位之間的共享，有效的打擊玉米假冒偽劣品種，提高玉米種子的供應(yīng)質(zhì)量，促進我國農(nóng)作物品種產(chǎn)業(yè)健康穩(wěn)定的發(fā)展。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，今后將涌現(xiàn)許多更有效的新型分子標記，還要將SSR分子標記技術(shù)進一步改良與完善，開發(fā)新型SSR-PCR結(jié)果讀取儀器，做到智能化和高通量，提高玉米種子純度的檢測質(zhì)量和效率。只有這樣，SSR分子標記技術(shù)才能為玉米種子純度的高效檢測和建立玉米種業(yè)產(chǎn)業(yè)的信息化質(zhì)量監(jiān)控體系提供技術(shù)支撐。

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（本文責(zé)編：鄭立龍）