石穎 王桂英 王長娜 劉俠 闞玉文 郜秋華 張恭 車文利 龐國新

摘要?以秘魯野生細葉番茄為試材，采用不同植物激素組合及不同光照對比培養(yǎng)方法，對野生番茄愈傷組織誘導及愈傷生長特性進行了研究。結果表明，MS+6-BA （0.05～2.0 ） mg/L +NAA 0.5 mg/L、MS+NAA 0.5 mg/L或2，4-D 0.5 mg/L均可誘導葉片及莖段愈傷化。不同光照條件（強光、弱光及黑暗培養(yǎng)）下愈傷發(fā)生顏色變化。無論光照或暗培養(yǎng)，愈傷組織增生速度均較快，20 d生長量為原來的3～14倍。根據(jù)定性和定量調查確定MS+NAA 0.5 mg/L為秘魯野生細葉番茄愈傷光培養(yǎng)或暗培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基。該研究為野生番茄在基因工程上的利用奠定了技術基礎。

關鍵詞?秘魯野生細葉番茄;愈傷組織;植物激素;生長特性

中圖分類號?S641.2文獻標識碼 A文章編號?0517-6611（2018）35-0047-03

番茄（Solanum lycopersicum L.）作為重要的蔬菜作物和模式植物，在諸多方面已有研究報道，如在生理生化上對于野生與栽培番茄的耐鹽性研究[1-3];利用子葉和下胚軸等外植體誘導植株再生[4-5];在基因工程方面抗逆、抗病、耐儲藏等基因的遺傳定位、克隆[6-9];以及農桿菌介導的抗病、抗蟲、耐鹽、耐除草劑等基因的遺傳轉化[10-13]。栽培番茄通常具有較高的商品性狀，但易受逆境脅迫和病蟲侵害。而野生番茄則是抗病、耐鹽、耐冷、耐貯藏等抗逆基因及抗線蟲、晚疫病、病毒病等抗病蟲基因的主要來源[7-8]。目前野生番茄的種類較多，如細葉番茄（S.pimpinellifolium）、秘魯番茄（S.peruvianum）、多毛番茄（S.habrochaites）、潘那利番茄（S.pennellii）、小花番茄（S.neorickii）等[14]，其中細葉番茄生長于秘魯，它和栽培番茄可以相互雜交，親緣非常接近，是惟一表現(xiàn)出與栽培番茄有天然漸滲現(xiàn)象的野生種。該研究對秘魯野生細葉番茄（S.pimpinellifolium）的愈傷組織培養(yǎng)特性進行研究，以期為野生番茄基因工程中的利用提供基礎性資料。

1?材料與方法

1.1?植物材料?秘魯野生細葉番茄（S.pimpinellifolium），來源于廊坊市農林科學院作物研究所。

1.2?培養(yǎng)基?愈傷誘導培養(yǎng)基參照文獻[15-16]及多年組培經驗設計，以MS為基本培養(yǎng)基，每升添加瓊脂粉5.5 ～6.0 g，白糖30 g，調pH至5.8～6.0。愈傷組織誘導激素為6-BA、NAA和2，4-D。培養(yǎng)基編號及配方如下：① MS+ 6-BA 0.05 mg/L+NAA 0.5 mg/L;② MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L;③ MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L;④ MS+NAA 0.5 mg/L;⑤ MS+2，4-D 0.5 mg/L。

1.3?方法?愈傷組織誘導培養(yǎng)基確立：利用野生細葉番茄組培苗葉片和莖段等外植體，放置于添加不同激素的培養(yǎng)基上，觀察愈傷誘導及繼代生長情況，篩選確立出愈傷培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基。

野生細葉番茄愈傷細胞生長速度量化調查：將番茄愈傷接種時先稱重，接種到④和⑤中，每種培養(yǎng)基各接種4瓶，每瓶4團愈傷，接種后將愈傷團按重量由輕到重分別編號為1～16號。光照下（2 000 lx，12 h/d）培養(yǎng)20 d后再次稱重，數(shù)據(jù)錄入到Excel中進行分析，明確野生番茄固體培養(yǎng)的生長速度。

愈傷在不同光照條件下的生長特性研究：選擇在同一培養(yǎng)基上（MS+6-BA 0.05 mg/L+NAA 0.5 mg/L）多次繼代、顏色質地均勻的愈傷，接種到培養(yǎng)基④上，進行光照培養(yǎng)（2 000 lx，12 h/d）、弱光培養(yǎng)（500 lx，8 h/d）和暗培養(yǎng)（全天無光照）。培養(yǎng)20 d時，觀察記錄愈傷細胞顏色變化，接種后和調查時均拍照。

2?結果與分析

2.1?不同培養(yǎng)基愈傷誘導?葉片和莖段等外植體在上述培養(yǎng)基中會逐漸愈傷化，經在相同培養(yǎng)基上繼代轉接，①～⑤號培養(yǎng)基均可誘導愈傷組織產生（表1）。其中①和②③對比，①中的愈傷生長速度較快，細胞相對疏散，顏色為米黃色，②號淡綠色，③號愈傷最綠。④和⑤培養(yǎng)基對比，④上誘導的愈傷顏色為白綠色，生長速度相對較快。

在①～③中繼代轉接，14d后愈傷即長滿瓶。①號中愈傷越來越疏松，顏色變淺，③號中愈傷較為致密、硬。這3種

培養(yǎng)均添加NAA0.5 mg/L，差別是6-BA濃度由0.05 mg/L→0.5 mg/L→2 mg/L。愈傷組織在④號和⑤培養(yǎng)基中繼代轉接，④號愈傷白中帶綠;⑤號愈傷也微有綠色，有暗色細胞出現(xiàn)，表現(xiàn)水漬狀。圖中⑥是接種初愈傷形態(tài)及顏色。

2.2?野生細葉番茄愈傷細胞生長速度?光照下培養(yǎng)20 d后，1～16號愈傷團均按照接種初愈傷重量由輕到重排列。由圖中數(shù)據(jù)分析可看出：不同愈傷團的凈增長量存在差別，按照接種初重量由低到高升序排列，20 d后的重量卻沒有出現(xiàn)規(guī)則的升序排列狀態(tài)?？傮w是：④生長量是原來的3～14倍，⑤生長量是原來的3～10倍。

取出愈傷破壞性調查：⑤上的愈傷水分含量高，水漬狀;④相對較干，為濕沙狀。從顏色看：⑤上的愈傷有較多變黑細胞;④細胞色淺，米白色，顏色相對均勻。綜合分析，選擇④作為番茄愈傷繼代培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基。

2.3?不同光照下愈傷生長對比?愈傷組織在強光、弱光及完全黑暗培養(yǎng)20 d時調查，最初接種的淺白愈傷團表現(xiàn)出3種顏色：淺白色、暗黑色和黃褐色。變黑及褐化程度上：強光>弱光>全黑暗。強光下多數(shù)愈傷為白色，呈現(xiàn)黑色的極少，有個別愈傷團為微黃色。弱光及全黑暗白色愈傷相對少，黑化及褐化較多。3種光照條件下繼續(xù)培養(yǎng)30 d，黑色及黃褐色進一步加深，有的整瓶愈傷變黑色或黃褐色。黑暗培養(yǎng)的愈傷挑選其中的色淺細胞轉接繼續(xù)暗培養(yǎng)，細胞生長出現(xiàn)好轉，淺色多，也有微黑出現(xiàn)。

由不同光照下愈傷培養(yǎng)變化可以看出：經過20 d的培養(yǎng)，番茄愈傷在光照下培養(yǎng)，新生組織多為白色，少數(shù)出現(xiàn)黑色和乳黃色。在弱光或完全黑暗下，新生細胞黑色與淺色混雜，且黑色細胞較多，也有不發(fā)黑但為乳黃色的細胞團。挑選淺色細胞黑暗繼代培養(yǎng)，經多次繼代后可獲得穩(wěn)定的白色愈傷，不再發(fā)生顏色改變。

3?結論與討論

秘魯野生細葉番茄外植體愈傷誘導較易，NAA 0.5 mg/L單獨使用或配合6-BA （0.05～?2.0 mg/L）均可使葉片莖段等材料愈傷化，但隨著6-BA濃度的升高，愈傷由松散變得致密，顏色由淡綠變?yōu)闈饩G。

愈傷組織無論光照或暗培養(yǎng)，細胞增生速度均很快，20 d生長量為原來的3～14倍。根據(jù)定性和定量調查確定MS+NAA 0.5 mg/L為秘魯野生細葉番茄愈傷光或暗培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基。光照條件下培養(yǎng)，新生組織多為白色，少數(shù)細胞團整體表現(xiàn)乳黃色。在弱光或完全黑暗條件下，新生細胞黑色與淺色混雜，也有不發(fā)黑但整體為乳黃色的細胞團。挑選淺色細胞團繼代培養(yǎng)變黑現(xiàn)象減輕。白色和乳黃色細胞團為顆粒狀，用鑷子碰觸有沙沙音;黑色細胞團為絮狀，碰觸無聲音，初步判斷細胞已死。細胞團出現(xiàn)整體而不是部分黑化及乳黃色，應該與某種物質的產生及傳遞有關，具體機制及原因不明。

愈傷在增生速度與顏色上出現(xiàn)的變化及差異，原因在于番茄愈傷由不同組織誘導出，細胞也處于混雜狀態(tài)，因此，繼代轉接時需要進行篩選淘汰。經過篩選可獲得增生穩(wěn)定、顏色均一的愈傷。無論是光照培養(yǎng)或暗培養(yǎng)，細胞增生速度均很快，所以轉接周期不宜太長，以15～20 d一個周期為宜。

參考文獻

[1] 陳火英，張建華，鐘建江，等.番茄愈傷組織和植株耐鹽性的比較研究[J].上海交通大學學報（農業(yè)科學版），2001，19（1）：49-54.

[2] 張建華，劉風榮，陳火英.野生番茄和栽培番茄的耐鹽差異性比較研究[J].上海交通大學學報（農業(yè)科學版），2006，24（6）：533-536，540.

[3] 敖雁，管永祥，孫云賀，等.基于離子穩(wěn)態(tài)的野生與栽培番茄及其雜交F1的耐鹽性差異[J].土壤學報， 2016，53（4）：1065-1073.

[4] GUBI J，LAJCHOV Z，F(xiàn)ARAG J，et al.Effect of genotype and explant type on shoot regeneration in tomato （Lycopersicon esculentum Mill.） in vitro[J].Czech J Genet Plant Breed，2003，39（1）：9-14.

[5] 梁美霞.番茄子葉和下胚軸離體再生體系建立[J].中國農學通報，2010，26（6）：47-50.

[6] 李廣存，畢玉平，李杰文，等.番茄乙烯形成酶基因的克隆及其反義基因的表達載體構建[J].山東農業(yè)科學，1999，22（3）：19-22.

[7] 劉冰.野生醋栗番茄耐冷基因的滲入及遺傳定位[D].北京：中國農業(yè)科學院，2009.

[8] 程希.番茄野生種及栽培種抗病同源基因的克隆與分析[D].武漢：華中農業(yè)大學，2010.

[9] 余慶輝.利用野生番茄Solanum pennellii LA716漸滲系群體進行番茄耐鹽相關QTLs定位[D].南京：南京農業(yè)大學，2011.

[10] FILLATTI J J，KISER J，ROSE R，et al.Efficient transfer of a glyphosate tolerance gene into tomato using a binary Agrobacterium tumefaciens vector[J].Bio/Technol，1987，5（7）：726-730.

[11] FISCHHOFF D A，BOWDISH K S，PERLAK F J，et al.Insect tolerant transgenic tomato plants[J].Bio/Technol，1987，5（8）：807-813.

[12] GISBERT C，RUS M A，BOLARN C M，et al.The yeast HAL1 gene improves salt tolerance of transgenic tomato[J].Plant Physiol，2000，123（1）：393-402.

[13] JIA G X，ZHU Z Q，CHANG F Q，et al.Transformation of tomato with the BADH gene from Atriplex improves salt tolerance[J].Plant Cell Rep，2000，21（2）：141-146.

[14] 趙凌俠.番茄野生資源[M].上海：上海交通大學出版社，2012.

[15] 周金梅，宮敬利.不同培養(yǎng)基配方對L-402番茄愈傷組織的誘導研究[J].北方園藝，2010（21）：158-160.

[16] 馬義勇，顏雪芬，劉思言，等.番茄愈傷組織誘導的初步研究[J].北方園藝，2012（6）：106-108.