王麗麗 李琳琳 張楠楠 王燁 駱新 陶義存 毛新民

[摘要] 目的 觀察兩色金雞菊黃酮類化合物黃諾瑪苷對高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）氧化應(yīng)激及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和細胞間黏附分子-1（ICAM-1）蛋白表達的影響。 方法 將HUVEC細胞分為正常對照組（NG）、高糖模型組（HG）及不同濃度黃諾瑪苷組（50、100、200、400 μmol/L）。酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELASA）檢測細胞上清液中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活性。用Western blot方法檢測細胞中VEGF和ICAM-1蛋白表達水平。 結(jié)果 與NG組比較，HG組MDA明顯升高，SOD、CAT、GSH-Px明顯降低（P < 0.05或P < 0.01）。與HG組比較，黃諾瑪苷干預(yù)后，MDA含量顯著降低（P < 0.05），SOD、CAT、GSH-Px活力顯著上升（P < 0.05）。Western blot結(jié)果顯示，與NG組比較，HG組VEGF和ICAM-1蛋白表達量增多（P < 0.05或P < 0.01）。與HG組比較，黃諾瑪苷干預(yù)后VEGF和ICAM-1蛋白表達量隨濃度遞增而依次減少（P < 0.05或P < 0.01）。 結(jié)論 黃諾瑪苷可能通過改善氧化應(yīng)激水平和下調(diào)VEGF、ICAM-1的表達對高糖誘導(dǎo)HUVEC損傷具有一定保護作用。

[關(guān)鍵詞] 黃諾瑪苷；人臍靜脈內(nèi)皮細胞；氧化應(yīng)激；血管內(nèi)皮生長因子；細胞間黏附分子-1

[中圖分類號] R96 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）04（a）-0008-05

[Abstract] Objective To observe the effects of flavanomarein glycosides of Coreopsis tinctoria Nutt. on oxidative stress and expression of vascular endothelial growth factor （VEGF） and intercellular cell adhesion molecule-1 （ICAM-1） protein in human umbilical vein endothelial cells （HUVEC） induced by high glucose. Methods The cultured HUVEC cells were divided into normal control group （NG group）， high glucose model group （HG group） and different concentrations of flavanomarein group （50， 100， 200， 400 μmol/L）. The activity of malondialdehyde （MDA）， superoxide dismutase （SOD）， catalase （CAT） and glutathione peroxidase （GSH-Px） in supernatant were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELASA）. The expression levels of VEGF and ICAM-1 protein in cells were detected by Western blot method. Results Compared with NG group， the content of MDA in HG group was significantly increased， the levels of SOD， CAT and GSH-Px in HG group were significantly decreased （P < 0.05 or P < 0.01）. Compared with HG group， after flavanomarein intervention， the content of MDA in HG group was significantly decreased， CAT， GSH-Px activity increased significantly （P < 0.05）. The results of Western blot showed that compared with NG group， the expression of VEGF and ICAM-1 protein in HG group increased （P < 0.05 or P < 0.01）. Compared with HG group， after flavanomarein intervention， the expression of VEGF and ICAM-1 protein increased with the increase of concentration followed by reduction （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Flavanomarein has a protective effect on HUVEC induced by high glucose may be through improving the level of oxidative stress and decreasing the levels of VEGF and ICAM-1.

[Key words] Flavanomarein glycosides； Human umbilical vein endothelial cells； Oxidative stress； Vascular endothelial growth factor； Intercellular cell adhesion molecule-1

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是微血管并發(fā)癥之一，可造成不可逆轉(zhuǎn)的視力喪失，其發(fā)病機制復(fù)雜[1]。氧化應(yīng)激（OS）與DR的發(fā)生發(fā)展存在關(guān)聯(lián)性。高血糖會在一定程度上導(dǎo)致體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，而氧化應(yīng)激通過對內(nèi)皮細胞及線粒體的損害，造成代謝通路異常，加重炎性反應(yīng)[2]。研究表明，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和細胞間黏附分子1（ICAM-1）與DR的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其介導(dǎo)的新生血管生成及炎性反應(yīng)在DR的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，抑制血管內(nèi)皮細胞VEGF和ICAM-1失衡是DR防治的重要靶方向[3]。兩色金雞菊Coreopsis tinctoria Nutt.具有清熱、活血健脾的功效[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，其提取物對實驗動物血糖、血脂、血壓異常均有一定影響，并顯著降低糖尿病大鼠視網(wǎng)膜相關(guān)炎癥因子的表達，黃諾瑪苷為其重要的活性成分之一[5-11]。本研究通過觀察黃諾瑪苷對高糖誘導(dǎo)損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）的氧化應(yīng)激指標及VEGF和ICAM-1表達的影響，探討其對HUVEC的保護作用，為黃諾瑪苷治療DR提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗對象 人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC），由新疆醫(yī)科大學中心實驗室提供。

1.1.2 主要試劑 黃諾瑪苷（ChromDex有限公司，加拿大，批號：ZES-0058S）；CCK8（日本同仁，批號：CK04）；DMEM培養(yǎng)基（Hyclon公司，批號：SH30022.01）；葡萄糖（Sigma公司，批號：G7528）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）酶聯(lián)免疫試劑盒（上海鈺博生物科技有限公司，批號：E20170916A）；BCA蛋白定量試劑盒（Thermo公司，批號：23227）；VEGFA抗體（abcam公司，批號：ab46154）；ICAM-1抗體（proteintech公司，批號10831-1-AP）；β-actin抗體（博奧森，bs-0061R）；磷酸酶標記二抗（北京博奧森，批號：AF01201181）；AP顯色液（Invitrogen，批號：WP20001）；凝膠制備試劑盒（北京索萊寶公司，批號：20170207）；PVDF膜（Millipore，批號：IPVH00010）；脫脂奶粉（BD，LOT：4143845）。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組 將HUVEC細胞分為正常對照組（NG組）、高糖模型組（HG組）及不同濃度黃諾瑪苷組（50、100、200、400 μmol/L）。NG組：正常細胞+DMEM低糖培養(yǎng)基（5.56 mmol/L葡萄糖）。HG組：正常細胞+DMEM高糖培養(yǎng)基（50 mmol/L葡萄糖）。50、100、200、400 μmol/L黃諾瑪苷組：正常細胞+50 μmol/L黃諾瑪苷+DMEM高糖培養(yǎng)基（50 mmol/L葡萄糖）；正常細胞+100 μmol/L黃諾瑪苷+DMEM高糖培養(yǎng)基（50 mmol/L葡萄糖）；正常細胞+200 μmol/L黃諾瑪苷+DMEM高糖培養(yǎng)基（50 mmol/L葡萄糖）；正常細胞+400 μmol/L黃諾瑪苷+DMEM高糖培養(yǎng)基（50 mmol/L葡萄糖）。

1.2.2 CCK-8檢測細胞活性 將處于對數(shù)生長期細胞接種在96孔板中，濃度調(diào)整為5×104個/mL，加細胞懸液100 μL/孔，設(shè)5個復(fù)孔。細胞貼壁后，按上述分組，給予100 μL各濃度無血清含藥培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，每孔加CCK-8 10 L，孵育2 h。450 nm處測吸光度值。

1.2.3 細胞上清液中MDA、SOD、CAT、GSH-Px測定 接種細胞（密度為5×104個/孔）于96孔板中，藥物干預(yù)按“1.2.1”分組進行，每組5個復(fù)孔。孵育24 h后，收集上清液，檢測上清液中MDA含量和SOD、CAT、GSH-Px活力。

1.2.4 Western blot檢測VEGF、ICAM-1蛋白表達水平 將細胞接種于10 cm的細胞培養(yǎng)皿中，按分組給予無血清含藥培養(yǎng)液，孵育24 h，提蛋白，測含量。跑膠、電泳1.5 h，轉(zhuǎn)膜2.5 h，封閉1.5 h，一抗4℃過夜，二抗孵育2 h，顯色、凝膠圖像分析軟件對結(jié)果進行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD法，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8檢測結(jié)果

與NG組比較，HG組細胞活力明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。與HG組比較，黃諾瑪苷（50、100、200、400 μmol/L）組細胞活力均明顯升高，差異有統(tǒng)高度計學意義（P < 0.01）。見圖1。

2.2 黃諾瑪苷對高糖誘導(dǎo)HUVEC細胞損傷MDA含量和SOD、CAT、GSH-Px活力的影響

與NG組比較，HG組中MDA明顯升高（P < 0.01），SOD、CAT、GSH-Px活力明顯降低（P < 0.05或P < 0.01）；與HG組比較，黃諾瑪苷干預(yù)后上清液中MDA含量顯著降低（P < 0.05），SOD、CAT、GSH-Px活力顯著上升（P < 0.05）。見表1。

2.3 黃諾瑪苷對HUVEC細胞VEGF和ICAM-1蛋白表達的影響

2.3.1 黃諾瑪苷對HUVEC細胞VEGF蛋白表達的影響 與NG組比較，HG組VEGF蛋白相對表達量增加（P < 0.05）。與HG組比較，50 μmol/L黃諾瑪苷組蛋白表達量降低，但差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）；100、200、400 μmol/L黃諾瑪苷組蛋白相對表達量降低，且差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。見圖2。