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(1.中國科學(xué)院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 大豆分子設(shè)計(jì)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 哈爾濱150081；2.中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049；3.哈爾濱師范大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150052)

0 引 言

菜豆(PhaseolusvulgarisL.)在我國廣泛種植，地方品種資源豐富，是我國主要的蔬菜種類之一[1-2]，也是世界上重要的食用豆類之一[3-4]。食用菜豆富含維生素C，有利于提高人體免疫能力，可預(yù)防上呼吸道感染等疾病。維生素C作為抗氧化劑，能將膽固醇分解成硫化物而排出體外，從而清潔血管，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸和大腦發(fā)育[5]。菜豆品種黃金勾因豆莢果實(shí)色澤呈淺黃色，具有纖維少、味甘甜等獨(dú)特的口感，成為我國東北三省最具特色的地方品種之一。

與大豆相同，菜豆也是光周期敏感的短日照作物。在短日條件下，菜豆開花、結(jié)莢及成熟期均提前。反之，在長日條件下，菜豆開花、結(jié)莢及成熟期推遲，枝葉徒長，甚至不能開花結(jié)莢。光周期不僅影響菜豆開花結(jié)實(shí)的遲早，對葉的形態(tài)、生長習(xí)性、株高和產(chǎn)量等也具有一定影響[6]。生育期是光周期反應(yīng)的重要指標(biāo)，也是育種主要選擇的目標(biāo)性狀。大豆是早期研究光周期現(xiàn)象的重要模式作物[7-11]。經(jīng)典遺傳學(xué)發(fā)現(xiàn)了10多個與開花期相關(guān)的基因位點(diǎn)[12-19]，除與“長童期”相關(guān)的J位點(diǎn)[16]外，其余習(xí)慣稱為E系列(E1至E10)基因。大豆的生育期是大豆的生理特性在一定條件下的表現(xiàn)，是大豆重要的生態(tài)性狀[20]。在眾多的E基因中,大豆生育期基因E1對大豆的開花期及成熟期的影響最大[12,21-24]。Xia等[25]用2個含有不同E1基因型Harosoy近等基因系所建立的群體,成功地實(shí)現(xiàn)了對該基因的精細(xì)圖位克隆。其中E1基因只在菜豆和蒺藜苜蓿等豆科作物中發(fā)現(xiàn)有與其同源性很高的基因序列。來源于菜豆的E1同源基因PvE1L具有與大豆中E1基因相似的抑制開花的功能[26]。

通過比較植物遺傳連鎖圖譜，菜豆與大豆在宏線性水平和微線性水平都具有較高的共線性關(guān)系[27]。菜豆的基因組為587Mb[28]，小于大豆基因組。同時重復(fù)序列比例低，并可為較復(fù)雜的豆科植物基因組解析做參考。在植株生長上具有生長周期短，便于表型觀察等優(yōu)勢。最新的菜豆(Phaseolusvulgaris)基因組有 11 條染色體(http://phytozome.com)，是以三代測序技術(shù)PacBio為基礎(chǔ)拼裝而成，同時基因注釋是由GMI(Gene Model Improvement) 自動流程來完成的。本基因組版本已組裝了87個大于50 kb的scaffolds，代表著約99.1%的總基因組，注釋了27 433個基因位點(diǎn)，含有36 995個可翻譯蛋白的轉(zhuǎn)錄本，同時預(yù)測有9 562個可變剪切轉(zhuǎn)錄本。近年來，由基因組發(fā)展而來的技術(shù)手段如芯片技術(shù)[29]不斷出現(xiàn)，為基因克隆提供了極大的便利。

遺傳多樣性是作物遺傳改良的基礎(chǔ)，也是育種領(lǐng)域中最重要的前提。突變體被認(rèn)為是育種計(jì)劃中理想性狀的供體。誘變技術(shù)發(fā)展至今，主要有物理誘變、化學(xué)誘變和生物誘變，物理誘變主要包括：60Co γ 射線、航天誘變、激光誘變、熱中子誘變和快中子轟擊誘變等[30]；化學(xué)誘變主要包括：疊氮化納和烷化類誘變劑誘變等；生物誘變主要包括：T-DNA 插入誘變和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)誘變。Chen等[31]為解決菜豆種質(zhì)資源遺傳更新問題，通過化學(xué)誘變劑疊氮化納(NaN3)誘變地方菜豆品種Hwachia，獲得了具有不同性狀的突變體，達(dá)到了擴(kuò)大菜豆遺傳多樣性的目的。化學(xué)誘變劑甲基磺酸乙酯(EMS)具有產(chǎn)生點(diǎn)突變頻率較高，染色體畸變相對較少的誘變特點(diǎn)，可以產(chǎn)生范圍較廣的突變類型，如轉(zhuǎn)換、顛換等。Porch等[32]用EMS誘變菜豆品種BAT93，并通過比較EMS濃度梯度對植物存活、發(fā)育和產(chǎn)量等的影響，確定了40 mM EMS具有最佳的誘導(dǎo)效率。

與上述誘變技術(shù)相比較，60Co γ 射線誘變種粒后代突變性狀較為明顯，突變體易于觀察和篩選，被廣泛應(yīng)用于突變體庫的建立。本研究通過60Co γ輻射誘變旨在獲得豐富的變異材料，特別是與菜豆生育期性狀產(chǎn)生變異的材料，進(jìn)而進(jìn)行克隆引致變異的功能基因，豐富菜豆的生育期及光周期調(diào)控機(jī)制，為全面解析菜豆功能基因組提供重要的遺傳材料。

1 材料與方法

1.1 供試材料

菜豆品種黃金勾購自黑龍江都業(yè)電子商務(wù)有限公司。

1.2 誘變處理方式

黃金勾種子約2 500粒，在浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用研究所進(jìn)行60Co γ 射線誘變處理，吸收劑量為200 Gy，劑量率為每分鐘1 Gy。

1.3 突變體庫的建立與表型觀察

誘變處理后的種子于2016年5月種于哈爾濱市平房區(qū)試驗(yàn)田中，出苗約1 660株，約半數(shù)以上植株呈現(xiàn)死苗或遲發(fā)苗。于2016年8月左右單株收獲M1代800株種子；2016年11月于云南省中國科學(xué)院西雙版納植物園南繁基地進(jìn)行加代繁種，2017年4月底單株收獲M2種子；2017年5月中旬M2代單株收獲的種子于哈爾濱市平房區(qū)試驗(yàn)田和黑龍江省海倫市進(jìn)行種植，M3代群體植株總數(shù)為約為3 500株行，在田間定期觀察表型變化。根據(jù)觀察到的表型特征選擇株行的收獲方式，如有明顯性狀分離的植株單株收獲單株脫粒。選擇部分明顯變異的材料，在M4代進(jìn)行表型及分離比驗(yàn)證。M4代植株于2017年9月在江蘇省淮安市種植。鑒于M2代突變體容量相對較小，表型觀察始于M3代株行，全生育期每 2 ～ 3 d 田間調(diào)查 1 次，重點(diǎn)考察開花期、成熟期、葉形、葉色、株高、株型、育性、百粒重、豆莢與種子性狀等變異情況，并進(jìn)行數(shù)據(jù)記載。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法與數(shù)據(jù)分析

隨機(jī)選取菜豆黃金勾突變體庫110個株系，用電子天平測定百粒重，游標(biāo)卡尺測定種粒的長和寬。每株系分別隨機(jī)測量3次百粒重及種粒的長、寬，取平均值作為該品種的表型數(shù)值。野生型對照百粒重隨機(jī)測量30次。

用分析工具SigmaPlot 12.5結(jié)合Excel的分析功能對突變體庫部分種粒，大粒、小粒及野生型對照的平均值、最小值、標(biāo)準(zhǔn)誤差、偏度和峰度等指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體庫中數(shù)量性狀的觀察

110份種粒的百粒重變化范圍為20.9～46.4 g，野生型對照，均值為30.3 g。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示在百粒重、粒長及粒寬3個性狀中，突變體庫部分種粒變異系數(shù)均顯著高于野生型對照，野生型粒寬變異系數(shù)最小，為5.73%；突變體庫百粒重變異系數(shù)和變異幅度最大，百粒重變異系數(shù)為17.7%，變異幅度為20.9～48.7 g；突變體庫粒長、粒寬呈偏態(tài)分布，而百粒重呈高偏態(tài)分布，表明突變體庫中所研究的該性狀差異較大，存在豐富的遺傳多樣性且在群體中產(chǎn)生連續(xù)分布(表1)，而且突變體庫中部分材料在種皮顏色與野生型對照相比存在肉眼可見的顯著差異，見圖1。

圖1 黃金勾突變體庫部分種粒百粒重分布Fig.1 100-seed weight distribution of mutant library and wild type of Golden Hook

選取差異較大的代表性狀材料如大粒(菜434)、小粒(菜601)，與野生型對照分別隨機(jī)重復(fù)測定百粒重、粒長及粒寬各30次，方差分析結(jié)果顯示差異顯著(P<0.05)。菜434百粒重比野生型重8.31 g，重27.4%；菜601比野生型輕7.45 g，輕24.6%。菜434、菜601突變株種粒與野生型分布范圍差異明顯，百粒重和粒寬性狀分布存在顯著性差異，說明此次研究在數(shù)量性狀方面具有豐富的篩選潛力，可在育種研究中提供百粒重和粒型方面種質(zhì)優(yōu)良的親本，見圖2。

表1 黃金勾突變體庫與野生型百粒重、粒長及粒寬比較Table 1 A comparison of 100-seed weight,seed length and seed width between mutant library and wild type of Golden Hook

圖2 黃金勾突變體大粒、小粒與野生型百粒重、種粒長及種粒寬分布Fig.2 Distribution of 100-seed weight,seed length and width of wild type and mutants with large and small seed of Golden Hook

2.2 M1-3代植株表型變異觀察

經(jīng)60Co γ誘變處理的黃金勾于M1代田間種植出苗率明顯低于對照，出苗后白化及死苗率約20%，不少植株生長明顯遲緩，至出苗后一個月左右才恢復(fù)生長，說明處理劑量適中。M1代收獲的種子混收后，M2代種植在中國科學(xué)院西雙版納植物園園區(qū)內(nèi)(云南省)加代繁種，單株收獲。

60Co γ 射線輻射誘變處理菜豆黃金勾，M3代607株行發(fā)現(xiàn)了表型變異，占輻射誘變M3代群體總株行數(shù)的17.3%，其中葉性狀突變占總表型變異的50.4%，株高性狀突變占總表型變異的20.3%，見表2。

2.2.1 生育期性狀突變。生育期性狀包括開花與成熟期。因黃金勾生長周期短，開花較為集中，開花表型與成熟存在變異，總變異為34株行，見表2。

2.2.2 株型突變。因野生型品種為非蔓生的地架豆品種，在M3代表型的植株矮化較易觀察，共有123株行在株高上出現(xiàn)了明顯的變異。出現(xiàn)的矮化變異株行中，有39株行的野生型與矮化突變體的比例呈3∶1分離。

表2 菜豆品種黃金勾伽瑪射線突變體庫的M3代變異表型觀察Table 2 Phenotypic observation of a gamma-radiation-induced mutant library of Golden Hook in M3 generation

2.2.3 豆莢表型突變。誘變處理后得到的黃金勾突變?nèi)后w中，觀察到成熟期植株豆莢莢色呈綠色，豆莢寬大且直的寬豆莢變異植株，具有特異性，在M4代驗(yàn)證得到相同表型，見圖3A；因野生型黃金勾品種的可食用的豆莢為黃色且呈彎狀勾型，豆莢表型易于觀察。最典型的變異就是豆莢呈綠色，同時綠色豆莢的彎曲度變小呈直線型，勾狀特征消失，見圖3B。綠莢變異共8株行，其中2株行綠莢∶黃莢比例呈3∶1分離，1株行黃莢∶綠莢比例呈15∶1分離；除此之外還有分離比偏離3∶1分離的株行及所有株均為綠莢的株行。

注：A：大型豆莢變異；B：豆莢黃綠分離突變表型；C：葉色黃化；D：葉片皺縮突變。Note:A:Larger pod; B: Green pod ; C: Etiolated seedling; D:Wrinkly Leaf.圖3 菜豆黃金勾部分突變體表型變異Fig.3 Phenotypic variations of some Golden Hook mutants

2.2.4 葉突變。誘變處理后得到的菜豆黃金勾，葉部變異較易觀察。葉色突變常始于苗期，觀察到的共有379株行在葉型、葉色上有明顯變化。黃金勾突變?nèi)后w中葉性狀突變體占較大比重。白化苗在苗期大部分死亡，黃化苗葉色變化在苗期較為明顯[33]，見圖3C。同時觀察到有葉型變窄、葉片皺縮的突變表型，見圖3D。

2.2.5 種子突變。在株行或單株收獲、脫粒后觀察到種子形態(tài)發(fā)生變化，如種皮皺縮或種子大小上呈現(xiàn)明顯變異。

2.2.6 育性。不育表型在突變庫中較為豐富，見圖4。其中，有不同類型的不育特征。大多不育為產(chǎn)生無籽粒的肉莢。豆莢短小，長度最小僅有1.3 cm左右。但不育株中還產(chǎn)生少數(shù)幾粒籽粒，推測該不育類型為雄性不育，因昆蟲或風(fēng)媒的傳播致使能產(chǎn)生少數(shù)籽粒。還有一些類型，為花器官異常，如雙柱頭突變，即在一個花序處生長出兩個豆莢，且豆莢頂端重疊與畸型，見圖5A-C。

圖4 不育株和野生型 Fig.4 Sterile plant and wild type

圖5 雙柱頭突變體表型Fig.5 Sterile mutant with two stigmas per pod

2.3 重要突變體M4代表型驗(yàn)證

選取部分重要變異性狀株行，進(jìn)一步在M4代進(jìn)行表型觀察，驗(yàn)證M3代性狀觀察的結(jié)果。菜突230在M4代種植11株行共166株，其中2株行正常表型∶矮化突變體比例呈3∶1分離；菜突372在M4代種植10株行，其中3株行野生型∶葉片卷曲突變體比例呈3∶1分離；菜突777和菜突772表型均發(fā)生明顯變異，符合M3代表型觀察結(jié)果，并在菜突772中發(fā)現(xiàn)新表型變異材料如雙柱頭突變。

3 討 論

本研究運(yùn)用輻射誘變的方法使生物DNA損傷或斷裂，在修復(fù)過程中發(fā)生錯誤拼接與復(fù)制，致使其表型產(chǎn)生變異，輻射誘變在培育優(yōu)良種質(zhì)資源的研究中更是獲得了很多的成就。彭振英等[34]利用60Coγ輻射誘變處理花生種子進(jìn)行并構(gòu)建花生突變體庫，獲得了如高油突變體、高蛋白突變體等有價值的突變體，為花生功能基因組學(xué)研究提供了豐富的材料。鹿文成等[35]利用60Coγ輻射誘變大豆種子，經(jīng)多代選育早熟、高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)及廣適性等突出特點(diǎn)的大豆新品種，為大豆產(chǎn)量和品質(zhì)的提高提供良好的種質(zhì)基礎(chǔ)。

不同于表型差異明顯的質(zhì)量性狀，個體差異表現(xiàn)連續(xù)的數(shù)量性狀由多基因控制。百粒重是大豆等作物產(chǎn)量方面的重要農(nóng)藝性狀，也是重要的育種目標(biāo)之一[36]。菜豆突變體的百粒重、粒型分析在一定程度上優(yōu)化突變體材料的選擇和應(yīng)用，擴(kuò)大優(yōu)良單株的繁種優(yōu)勢，在今后的研究中找出與菜豆百粒重、粒型關(guān)系密切的相關(guān)因素，可為菜豆育種提供重要的種質(zhì)資源，根據(jù)需求選育優(yōu)良品種。

菜豆具有生長周期短，基因組小，重復(fù)序列比率低，營養(yǎng)價值高及與大豆親緣關(guān)系近等特點(diǎn)，所建立的突變體庫對于研究菜豆基因組功能具有重要意義。本研究通過伽瑪誘變處理所獲得菜豆突變體庫中，已觀察到了豐富的變異類型如在株型、葉部性狀、莢部性狀、籽粒大小及生育期性狀與育種上均獲得了較為豐富的可觀察的性狀。其中不少變異性狀是研究大豆光周期反應(yīng)、產(chǎn)量性狀等功能基因及基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要遺傳材料。

前期的研究表明，我國主要菜豆品種為短日照作物，但品種間生育期與光周期反應(yīng)存在著明顯的差異，其分子機(jī)理并不明確。研究明確其相關(guān)的分子基礎(chǔ)，在理論上可以解釋菜豆為什么為短日照作物，可與大豆的光周期反應(yīng)途徑進(jìn)行比較；在生產(chǎn)上可通過分子設(shè)計(jì)育種來培育具有不同生育期長度與不同光周期反應(yīng)敏感性的品種，擴(kuò)大品種的種植范圍等具有重要應(yīng)用前景。本突變體庫中所獲得的成熟期變異，在M3株行中如該性狀出現(xiàn)明顯的3∶1分離比，可以通過極端性狀混池測序，并利用現(xiàn)代的生物信息學(xué)技術(shù)手段鑒定可能的候選基因。同時將突變體與不同生態(tài)類型的菜豆品種雜交配制遺傳定位群體，驗(yàn)證所鑒定出的候選基因準(zhǔn)確性。在獲得候選基因的基礎(chǔ)上，進(jìn)行功能驗(yàn)證。

我們將繼續(xù)在除哈爾濱市以外具有季節(jié)特點(diǎn)的育種基地對菜豆品種黃金勾南繁加代，投入更多精力，深入、細(xì)致地對特殊材料進(jìn)行觀察、記錄表型、測量行間距等研究，選育出具有穩(wěn)產(chǎn)、廣適用性的菜豆新品種。目前，菜豆光周期開花調(diào)控的研究依然停留在基因的定位水平，基因功能的研究很少，這些突變體新性狀的發(fā)現(xiàn)不僅豐富了菜豆的育種信息，也為豆科植物基因功能的分析提供材料。

本論文所報(bào)道的表型，是初步肉眼所能觀察的簡單性狀的表型，具有特殊風(fēng)味口感的黃金勾品種在纖維素含量、次生代謝物質(zhì)、維生素含量及類胡蘿卜素等含量上還要經(jīng)過生物學(xué)測定，特別是利用現(xiàn)代代謝組學(xué)的技術(shù)手段來進(jìn)行研究。

在本試驗(yàn)中，我們還利用黑龍江大學(xué)提供的一個矮生15品種，用同樣的方法制成了一個大莢類型的菜豆品種的小型突變體庫。該品種屬于我國東北地區(qū)特有的地方油豆角品種，具有豆莢大、綠色、植株為非蔓生的矮桿類型等特點(diǎn)。兩個突變體不僅代表兩個不同類型，同時所獲得的突變體可相互與對方品種的野生型配制雜交組合來配制驗(yàn)證遺傳群體。

雖然部分性狀已在M4代中得以驗(yàn)證與較深入的研究，大多突變株庫的材料，將于今后數(shù)年陸續(xù)種植，很多材料將會繼續(xù)分離出不同變異類型的表型性狀，同時，我們要建立一個Tilling 群體，用于篩選不同基因的變異類型。

本試驗(yàn)中所獲得的很多與產(chǎn)量性狀直接相關(guān)的性狀，如大莢性狀、多莢性狀可直接用于育種中?？傊钊胙芯奎S金勾突變體庫中的重要的突變類型，有利于我們加深對菜豆基因組的了解，同時在為豆科其他近緣種的基因功能及豆科植物的進(jìn)化提供重要的遺傳材料。

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