土霉素降解菌篩選及降解特性研究

孟應(yīng)宏，馮 瑤，黎曉峰，劉元望，李兆君*

（1 廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南寧 530004；2 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所/農(nóng)業(yè)部植物營(yíng)養(yǎng)與肥料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

近年來，抗生素在畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖中的過量使用，導(dǎo)致環(huán)境中耐藥菌的產(chǎn)生和食品中藥物的殘留，已引起社會(huì)各界廣泛關(guān)注[1–3]。我國(guó)是抗生素生產(chǎn)和使用大國(guó)，每年抗生素生產(chǎn)量達(dá)21萬噸，使用量達(dá)18.9萬噸，其中獸用抗生素占到一半以上[4]，主要應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖中的抗生素主要有四環(huán)素類、青霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類等，其中，四環(huán)素類抗生素 (土霉素、四環(huán)素、金霉素等) 由于其具有質(zhì)優(yōu)價(jià)廉、廣譜性的特點(diǎn)，因而在畜禽養(yǎng)殖中被廣泛使用[5–7]。長(zhǎng)期以來，抗生素的廣泛使用，取得了良好的效果。然而，濫用抗生素逐漸成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)問題[8–9]。據(jù)報(bào)道，進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)的抗生素約有60%～90%會(huì)隨著糞便、尿液等排泄物排出[10]，進(jìn)而作為有機(jī)肥施入農(nóng)田，這會(huì)對(duì)土壤、水體等環(huán)境產(chǎn)生不利影響。土壤中土霉素的主要來源為含有土霉素的畜禽糞便、污泥和廢棄物[11]。有研究表明，我國(guó)土壤、水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)沉積物中可檢測(cè)到的土霉素含量高達(dá)200 mg/kg[12]、285 mg/kg[1]。因此，開展殘留土霉素的高效降解等研究很有必要。

環(huán)境中殘留抗生素的處理方法大致分為物理、化學(xué)和生物降解三種，其中，生物降解具有成本低廉、方法簡(jiǎn)單、微生物處理高效、環(huán)境修復(fù)好等優(yōu)點(diǎn)[13–14]，是治理環(huán)境污染的有效手段。微生物作為生物降解的主體[15]，對(duì)抗生素殘留的降解起關(guān)鍵作用。對(duì)于抗生素的微生物降解，主要是具有降解功能的抗生素的耐藥菌，因?yàn)檫@些耐藥菌能夠產(chǎn)生相應(yīng)的降解酶，這些酶類進(jìn)一步通過修飾或水解作用破壞抗生素的分子結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致抗生素降解[16]。目前已有一些和抗生素降解菌相關(guān)的研究，例如，碳角菌屬(Xylaria digitata) 能通過使碳核結(jié)構(gòu)中間的兩個(gè)環(huán)裂開從而降解四環(huán)素，最終導(dǎo)致四環(huán)素失效[17]，土壤中分離到能夠高效降解泰樂菌素的無丙二酸檸檬酸桿菌[18]，豬糞中四環(huán)素類抗生素在土壤中能隨微生物降解等作用而逐漸減少[19]，生產(chǎn)四環(huán)素的藥渣中存在可降解四環(huán)素的酵母菌[20]，還有研究表明，在堆肥中添加外源菌劑可以有效去除四環(huán)素類抗生素的殘留[21]。對(duì)于土霉素降解菌的研究也有所報(bào)道，例如，從某土霉素生產(chǎn)廠污水池底泥中分離出一株以土霉素為唯一碳源的菌株[22]，從堆肥體系中分離到一株以土霉素為唯一碳源的降解菌[23]?？傮w來說，相關(guān)的研究還較少，自然界中大部分的微生物并不具有降解土霉素的能力，有研究表明，褐土和紅壤中的土著微生物對(duì)四環(huán)素和土霉素的降解均無顯著影響[24]，因此，對(duì)于土霉素降解菌的篩選需要更深入地研究。本研究旨在從污泥、藥渣和畜禽糞便中分離獲得土霉素的降解菌，并研究其降解特性，為今后發(fā)展高效降解土霉素的環(huán)保工程菌制劑并建立固定化微生物技術(shù)奠定基礎(chǔ)，并可減少土霉素在環(huán)境中的殘留，保障人和動(dòng)物的健康。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

試驗(yàn)樣品為菌肥、藥渣、畜禽糞便；土霉素(Oxytetracycline，OTC) 標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自德國(guó) Dr.Ehrenstorfer公司，其結(jié)構(gòu)式見圖1；甲醇、乙腈、正己烷 (色譜純) 購(gòu)自美國(guó)Fisher公司；磷酸為優(yōu)級(jí)純?cè)噭?；試?yàn)用水為娃哈哈純凈水；EDTAMcIlvaine緩沖液。豬糞、鋸末、小麥秸稈的基本理化性質(zhì)見表1。

圖 1 土霉素的分子結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Molecular structure of oxytetracycline

表 1 堆肥原料性質(zhì)Table 1 Properties of selected compost materials

土霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液及標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取土霉素標(biāo)準(zhǔn)品0.050 g，加入少量甲醇溶解，然后轉(zhuǎn)移到10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，配制成5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。標(biāo)準(zhǔn)溶液 (3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 mg/L) 均由儲(chǔ)存標(biāo)樣加甲醇稀釋配制而成。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)溶液保存在4 ℃冰箱內(nèi)。

1.2 培養(yǎng)基制作

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：用牛肉膏3 g、蛋白胨5 g、氯化鈉 5 g、瓊脂 18 g、蒸餾水定容至 1000 mL，用1 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.0～7.2后滅菌；

無機(jī)鹽培養(yǎng)基：氯化銨1 g、磷酸二氫鉀0.5 g、磷酸氫二鉀 1.5 g、硫酸鎂 0.2 g、氯化鈉 1 g、瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL，調(diào)節(jié)pH至7.0，高壓滅菌；

篩選培養(yǎng)基：在滅菌液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入土霉素母液。

1.3 土霉素降解菌的篩選

1.3.1 菌株的分離與純化 稱取 10 g 采集到的樣品于90 mL 滅菌蒸餾水的三角瓶中 (250 mL，內(nèi)含玻璃珠)，置于搖床中 30℃、200 rpm 振蕩 30 min，取出后靜置。吸取100 μL上清液，涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，置于30℃條件下培養(yǎng)2 d。將得到的菌落，在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板上劃線，依據(jù)菌落形態(tài)進(jìn)一步分離和純化，重復(fù)多次，直至得到單一菌落；然后將單菌落分別接入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30℃、180 rpm下遮光震蕩培養(yǎng)2 d，得到含有單一菌落的培養(yǎng)液。

1.3.2 菌株降解功能驗(yàn)證 取 100 μL 上述培養(yǎng)液上清液，分別涂布于以土霉素為唯一碳源且土霉素濃度為25 mg/L的土霉素?zé)o機(jī)鹽固體培養(yǎng)基平板上，30℃遮光培養(yǎng)2 d，按25 mg/L的梯度逐漸提高培養(yǎng)基中土霉素的濃度至100 mg/L，培養(yǎng)同上。經(jīng)馴化最終得到生長(zhǎng)快、菌落規(guī)則、耐高濃度土霉素的菌株，初步認(rèn)定為對(duì)土霉素具有降解能力的優(yōu)勢(shì)菌株。劃線培養(yǎng)，于4℃冰箱內(nèi)保存。

將分離得到的菌株分別轉(zhuǎn)接到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，然后將活化的菌液按1%的接種量轉(zhuǎn)接到以土霉素為唯一碳源的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，30℃、180 rpm振蕩條件下遮光培養(yǎng)7 d，最后用高效液相色譜法測(cè)定各菌株對(duì)土霉素的降解率。試管斜面保存土霉素降解率高的菌株，于4℃冰箱內(nèi)保存。

1.3.3 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 降解菌株接種于 100 mg/L 土霉素的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30℃、180 rpm條件下培養(yǎng)，于不同時(shí)間取樣，采用分光光度法檢測(cè)樣品的OD600值，以確定降解菌的生長(zhǎng)量。

1.3.4 土霉素含量的測(cè)定 采用 Alliance 2695 型高效液相色譜儀2998型PDA檢測(cè)器 (美國(guó)Waters公司)對(duì)土霉素含量進(jìn)行測(cè)定。取培養(yǎng)液1 mL，加入5 mL甲醇，搖勻，10000 rpm離心15 min，取上清液，用0.22 μm針筒式微孔濾膜過濾得到濾液，待測(cè)。色譜條件為：色譜柱 Sunfire C18(150 mm × 4.6 mm，3.5 μm，Waters，USA)，流動(dòng)相為0.05%磷酸水溶液(A) 和乙腈 (B)，流速為 1.0 mL/min，柱溫 35℃，進(jìn)樣體積20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為355 nm。洗脫程序?yàn)椋?～17 min，93.2% A，6.8% B。根據(jù)線性回歸方程計(jì)算出土霉素的含量，并采用以下公式計(jì)算降解率：

降解率=(對(duì)照樣殘量–實(shí)樣殘量)/對(duì)照樣殘量 ×100%

1.3.5 菌株降解條件優(yōu)化 選擇溫度、pH、轉(zhuǎn)速、接種量為研究對(duì)象，將降解菌株培養(yǎng)活化后接入到100 mg/L的土霉素培養(yǎng)基中，裝液量均為100 mL，在不同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)7 d，測(cè)定土霉素降解率。每個(gè)處理設(shè)置三個(gè)重復(fù)，并設(shè)空白對(duì)照。

1) 溫度：調(diào)節(jié)pH為7，接種量為1%，設(shè)置20、25、30、35、40、45℃ 6 個(gè)溫度梯度，180 rpm搖床培養(yǎng) 7 d。

2) pH：調(diào)節(jié) pH 分別為 3、4、5、6、7、8、9、10，接種量為 1%，30℃，180 rpm 搖床培養(yǎng) 7 d。

3) 轉(zhuǎn)速：調(diào)節(jié)pH為7，接種量為1%，設(shè)置110、130、150、170、190、210 rpm 6 個(gè)不同轉(zhuǎn)速，30℃ 搖床培養(yǎng) 7 d。

4) 接種量：調(diào)節(jié)pH為7，接種量分別為1%、2.5%、5%、10%，30℃，180 rpm 搖床培養(yǎng) 7 d。

1.4 土霉素降解菌堆肥試驗(yàn)

共設(shè)置3個(gè)處理，具體為：1) 不加入土霉素，不加入T4菌株 (CK)；2) 加入土霉素，不加入T4菌株 (OTC)；3) 加入土霉素，加入菌株 T4 (OTC + T4)。各處理碳氮比均為 25，接種量為 1 × 109cfu/kg，含水率均為60%，土霉素的濃度為50 mg/kg，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。把豬糞、鋸末和小麥秸稈進(jìn)行攪拌，將土霉素溶液和液體T4菌種均勻?yàn)⒌狡渲?，室溫條件下發(fā)酵。第1、3、5、7、14、21、28、35、45 d取樣，裝于自封袋，在–20℃保存以備分析。用固相萃取進(jìn)行提取，分析其中的土霉素含量。

數(shù)據(jù)分析、圖表繪制采用Excel和Origin 8.5軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 土霉素降解菌株的篩選

經(jīng)馴化、分離獲得10株耐土霉素的菌株，編號(hào)分別為 T1、T2、T3、T4、DX-1、DX-2、DX-3、ZC-1、ZC-2、ZC-3，其中 T1、T2、T3、T4 來源于菌肥，DX-1、DX-2、DX-3來源于畜禽糞便，ZC-1、ZC-2、ZC-3來源于藥渣。各菌株在以土霉素為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況見表2。其中T4菌的生長(zhǎng)情況最好，因此，選取T4菌作為進(jìn)一步研究的對(duì)象。

表 2 微生物菌落的生長(zhǎng)狀況Table 2 Growth condition of microbial colony

2.2 降解菌株的鑒定

T4菌的16S rDNA基因測(cè)序所得序列提交NCBI后，通過BLAST程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，T4菌與Pseudomonas sp.高度相似，在分子系統(tǒng)發(fā)育分類學(xué)上屬于假單胞菌，挑選相似度相近序列用MEGA 6.0按鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，得到 T4 16S rDNA 基因系統(tǒng)發(fā)育樹 (圖 2)。

2.3 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

采用分光光度法對(duì)T4降解菌的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行測(cè)定。由菌液光密度值 (OD600)(圖 3) 可見，0～6 h 為T4菌的生長(zhǎng)遲緩期，在6～32 h內(nèi)菌株生產(chǎn)達(dá)到對(duì)數(shù)期，菌株個(gè)數(shù)呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，32 h之后菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，菌數(shù)趨于飽和。

2.4 培養(yǎng)條件對(duì)土霉素降解效果的影響

2.4.1 溫度對(duì)菌株降解土霉素效果的影響 將 T4 菌接種于篩選培養(yǎng)基中，在不同的溫度下遮光振蕩培養(yǎng)7 d。由圖4可知，T4菌對(duì)土霉素的降解率隨溫度的升高先增加后減小。20℃時(shí)降解率為17.29%，隨著溫度的上升，土霉素降解率逐漸升高，30℃時(shí)降解率最高，達(dá)到了26.75%，之后降解率隨著溫度的升高而下降，45℃時(shí)降解率下降到16.38%。因此適宜的培養(yǎng)溫度是30℃。

2.4.2 pH 對(duì)菌株降解土霉素效果的影響 不同 pH 培養(yǎng)條件下，T4菌對(duì)土霉素的降解效果如圖5所示。當(dāng)培養(yǎng)基pH值較低時(shí)，隨著pH值的升高，T4對(duì)土霉素的降解率也隨之增加，pH值為3時(shí)降解率為13.68%，當(dāng)pH上升至7.0時(shí)降解率增至27.03%；當(dāng)培養(yǎng)基pH大于7.0時(shí)，菌株對(duì)土霉素的降解能力隨pH的升高逐漸減小，pH為10.0時(shí)的降解率為21.66%，pH值為7.0時(shí)降解效果最佳，且與培養(yǎng)基的初始pH值相一致。

2.4.3 轉(zhuǎn)速對(duì)菌株降解土霉素效果的影響 由圖 6 可知，T4菌對(duì)土霉素的降解效果隨著轉(zhuǎn)速的提高先增大后減小，所有處理中T4菌對(duì)土霉素的降解率均在20%以上。其中，當(dāng)轉(zhuǎn)速為150 rpm和170 rpm時(shí)T4菌對(duì)土霉素的降解率顯著高于其他處理，分別為26.18%和25.59%?？紤]到搖床高轉(zhuǎn)速耗能高的限制，選擇150 rpm作為優(yōu)化的轉(zhuǎn)速。

2.4.4 接種量對(duì)菌株降解土霉素效果的影響 圖 7 表明，接種量為1%時(shí)降解率為26.68%，隨著接種量增加，T4菌對(duì)土霉素的降解率略有下降，當(dāng)接種量增加至10%時(shí)降解率減小為23.83%。因此，綜合去除率和時(shí)間成本，選擇1%作為T4降解土霉素的適宜接種量。

圖 2 T4菌16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 16S rDNA gene system development tree of T4

圖 3 T4生長(zhǎng)曲線Fig. 3 Growth curve of T4

2.4.5 優(yōu)化條件下菌株對(duì)土霉素的降解效果 由前面的試驗(yàn)結(jié)果可知，T4菌對(duì)土霉素降解效果的優(yōu)化條件為溫度 30 ℃、pH 7.0、轉(zhuǎn)速 150 rpm、接種量1%。在優(yōu)化的條件下，添加100 mg/L土霉素培養(yǎng)T4降解菌7 d之后，測(cè)得T4菌對(duì)土霉素的降解率為26.29%。

2.4.6 土霉素降解菌堆肥試驗(yàn)結(jié)果 由圖 8 可知，在只加入了土霉素而沒有加入T4菌的OTC處理中，試驗(yàn)結(jié)束土霉素的去除率為81.25%，而加入了T4菌的OTC + T4處理在試驗(yàn)結(jié)束之后，其土霉素的去除率達(dá)到了93.21%，與OTC處理相比增加了11.96個(gè)百分點(diǎn)。由此可見，加入了T4菌后，土霉素的去除率有所提高，說明T4菌對(duì)于土霉素的進(jìn)一步去除能夠起到促進(jìn)作用，進(jìn)而降低土霉素殘留。

圖 4 溫度對(duì)T4降解土霉素的影響Fig. 4 Effect of temperature on the degradation of oxytetracycline by T4

3 討論

圖 5 pH對(duì)T4降解土霉素的影響Fig. 5 Effect of pH on the degradation of oxytetracycline by T4

圖 6 轉(zhuǎn)速對(duì)T4降解土霉素的影響Fig. 6 Effect of rotation speed on the degradation of oxytetracycline by T4

圖 7 接種量對(duì)T4降解土霉素的影響Fig. 7 Effect of bacterium quantity on the degradation of oxytetracycline by T4

圖 8 堆肥中土霉素隨時(shí)間的降解率Fig. 8 Degradation of oxytetracycline with composting time

近年來，關(guān)于土霉素的研究報(bào)道越來越多。有報(bào)道稱采用堆肥技術(shù)可以降解畜禽糞便中的土霉素，但其降解時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，而對(duì)土霉素微生物降解的研究報(bào)道比較少。有研究表明，通過添加芽孢桿菌復(fù)合制劑到畜禽糞便中可以有效促進(jìn)四環(huán)素類抗生素的降解[25]。本研究分離篩選的T4菌，經(jīng)鑒定為假單胞菌 (Pseudomonas sp.)。有報(bào)道顯示，假單胞菌能夠有效降解有機(jī)磷農(nóng)藥[26]、二氯酚[27]、毒死蜱[28–29]等有機(jī)污染物，而對(duì)土霉素的降解尚未見報(bào)道。有一些報(bào)道分離篩選得到部分土霉素降解菌，例如，從生產(chǎn)土霉素生產(chǎn)廠污水池底泥中分離得到一株能高效降解土霉素的蠟樣芽孢桿菌 (Bacillus cereus)，最高可降解200 mg/L土霉素[30]；在之后進(jìn)行的菌株降解功能驗(yàn)證以及菌株降解活性測(cè)定的試驗(yàn)中，進(jìn)一步驗(yàn)證了之前的結(jié)論。從長(zhǎng)期受四環(huán)素類抗生素污染的土壤中篩選獲得一株高效降解菌Achromobacter xylosoxidans，對(duì) 60 mg/L 土霉素的降解率最高，達(dá)66.3%[14]。本研究篩選得到的土霉素降解菌對(duì)100 mg/L土霉素降解率相對(duì)較低，可能與土霉素添加量和菌株降解特性有關(guān)。

從本試驗(yàn)結(jié)果看，溫度對(duì)微生物的新陳代謝有很明顯的調(diào)控作用，溫度過低或過高都會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)，導(dǎo)致生長(zhǎng)量較低，從而影響對(duì)土霉素的降解效果。pH也是影響微生物降解抗生素的主要因素之一。pH值太低或者太高都不利于T4菌對(duì)土霉素的降解，因?yàn)樘嵝曰蛱珘A性的環(huán)境都對(duì)T4菌的新陳代謝產(chǎn)生了抑制，其內(nèi)部的生化環(huán)境、菌體微觀結(jié)構(gòu)、酶的活性都會(huì)發(fā)生相應(yīng)的改變以此來適應(yīng)外部環(huán)境的改變，進(jìn)而影響到T4菌菌體的生長(zhǎng)，導(dǎo)致土霉素的降解受到影響?？梢钥吹?，當(dāng)pH大于7.0并逐漸提高時(shí)，土霉素的降解率相對(duì)酸性條件下較低，這可能與土霉素在酸性條件下結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定引起化學(xué)降解有關(guān)，此時(shí)部分土霉素C環(huán)破裂，形成內(nèi)酯型異構(gòu)體，無法被檢測(cè)出[30]。轉(zhuǎn)速對(duì)土霉素降解也會(huì)有影響。因?yàn)檗D(zhuǎn)速能夠?yàn)門4菌在降解土霉素的過程中提供所需的氧氣，促進(jìn)T4菌的生長(zhǎng)，從而促進(jìn)其對(duì)土霉素的降解。轉(zhuǎn)速太低或是太高都會(huì)產(chǎn)生不利的影響，轉(zhuǎn)速太低可能無法為其提供充足的氧氣；轉(zhuǎn)速太高，可能又會(huì)導(dǎo)致菌體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，影響其對(duì)土霉素的降解。接種量也是影響T4菌降解土霉素的一個(gè)因素，這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)液里面的菌體之間會(huì)因?yàn)闋?zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，從而影響其對(duì)土霉素的降解。

土霉素微生物降解研究目前仍處于起步階段，降解菌株缺乏，代謝機(jī)制以及實(shí)際應(yīng)用的開展等方面都還有很多的工作需要去做。本研究篩選得到的T4菌株對(duì)土霉素有較好的降解作用，具有潛在的實(shí)際使用價(jià)值，為進(jìn)一步找到土霉素生物降解酶打下了基礎(chǔ)，此外，繼續(xù)通過分子生物學(xué)方法探明菌株的降解基因，使其在微生物轉(zhuǎn)錄和翻譯中進(jìn)行表達(dá)，將成為降解環(huán)境中土霉素的新方向，具有很好的潛在開發(fā)利用價(jià)值。

4 結(jié)論

1) 本研究得到一株能夠較好降解土霉素的菌株T4，通過16S rDNA基因序列分析，鑒定屬于假單胞菌 (Pseudomonas sp.)。

2) 實(shí)驗(yàn)室條件下，T4菌對(duì)土霉素降解效果最佳的生長(zhǎng)條件為溫度30℃、pH 7.0、轉(zhuǎn)速150 rpm、接種量1%。在該條件下培養(yǎng)降解菌7 d，對(duì)100 mg/L土霉素的降解率為26.29%。

3) 堆肥試驗(yàn)表明，與對(duì)照相比，添加了T4菌的處理對(duì)土霉素去除有促進(jìn)作用。

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