苑珍珍 ，楊 召 ，金鴻賓 ，許海委

椎間盤退變是引起頸腰部疾患的前提和基礎(chǔ)。有統(tǒng)計(jì)顯示，世界上一半以上的人口會受到頸腰痛的困擾[1]。椎間盤連接上下兩個(gè)椎體，是維持脊柱結(jié)構(gòu)與功能的重要組成部分。髓核細(xì)胞是構(gòu)成椎間盤的主要成分，可以合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)，在椎間盤退變過程中發(fā)揮著重要作用。骨碎補(bǔ)是治療腎虛腰痛的常用藥，具有補(bǔ)腎壯骨，活血止痛的作用。柚皮苷作為其主要組成單體，研究顯示其具有抑制髓核細(xì)胞退變的作用，但作用機(jī)制報(bào)道較少[2]。本實(shí)驗(yàn)選取Fas/FasL通路，觀察柚皮苷對人退變椎間盤髓核細(xì)胞凋亡的影響，進(jìn)一步闡明其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 組織來源 人退變椎間盤髓核組織取自1例因椎間盤突出行椎間盤切除手術(shù)的患者，年齡50歲。術(shù)前取得患者同意，并簽署知情同意書。取材時(shí)嚴(yán)格無菌操作，取材后1h內(nèi)細(xì)胞室內(nèi)進(jìn)行髓核細(xì)胞分離培養(yǎng)。

1.2 主要試劑及儀器 DMEM培養(yǎng)基（GIBCO公司，美國），乙二胺乙酸二鈉（EDTA）（Sigma公司，美國），胎牛血清（GIBCO公司，美國），甲苯胺藍(lán)溶液（北京東勝泰博科技有限公司，北京）；CO2培養(yǎng)箱（Hera-cell公司，德國），恒溫?fù)u床（Heidolph公司，德國），倒置顯微鏡（OLYMPUS公司，日本），細(xì)胞培養(yǎng)板（Corning公司，美國），高通量實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈鎖反應(yīng)（PCR）儀（Roche公司，瑞士），百級層流細(xì)胞室（天津醫(yī)院細(xì)胞工程室）。

1.3 方法

1.3.1 人退變椎間盤髓核細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 將髓核組織用含青霉素和不含青霉素的D-Hanks液各沖洗3遍；將髓核組織剪碎，37℃下用0.25%的胰蛋白酶和0.2%的Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化40 min，消化期間一直放置于搖床上，輕輕晃動。收集消化液，1 000 r/min離心5 min，去除上清液。用DMEM/F12培養(yǎng)液吹勻細(xì)胞，再次離心，重復(fù)3次。用計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按1×106接種于底面積為25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入5 mL含青霉素100 U/mL、10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培養(yǎng)液。37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3 d換液1次，90%融合后用濃度為0.05%的胰酶消化傳代。

1.3.2 髓核細(xì)胞的鑒定 番紅O染色：P1代細(xì)胞多聚甲醛固定后，1%番紅O染色后，光鏡下觀察細(xì)胞分泌蛋白多糖能力。

甲苯胺藍(lán)染色：細(xì)胞固定后，1%甲苯胺藍(lán)染色10 min，磷酸鹽（PBS）緩沖液沖洗，封片，光鏡下觀察細(xì)胞分泌糖胺聚糖能力。

1.3.3 噻唑藍(lán)（MTT）法選擇柚皮苷抑制人髓核細(xì)胞凋亡的最佳濃度 采用MTT法測定不同濃度柚皮苷（0、20、40、80 μg/mL）對髓核細(xì)胞凋亡的抑制作用，髓核細(xì)胞加入含柚皮苷的培養(yǎng)基72 h后，用MTT實(shí)驗(yàn)檢測柚皮苷對髓核細(xì)胞的抑制作用，利用酶標(biāo)儀在720 nm波長處測定吸光度A，篩選柚皮苷抑制髓核細(xì)胞凋亡的最佳濃度，定為實(shí)驗(yàn)組，0 μg/mL柚皮苷為空白對照組。

1.3.4 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率 培養(yǎng)髓核細(xì)胞24 h，胰酶消化、計(jì)數(shù)、離心、洗滌、棄上清后再離心、重復(fù)洗滌細(xì)胞1次，加入5 μL膜聯(lián)蛋白V-FITC混合均勻后，避光孵育15 min后離心洗滌細(xì)胞，加入3 μL碘化丙啶混合均勻后，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測Fas、FasL、Caspase-8基因表達(dá)情況 實(shí)驗(yàn)組和對照組P3代髓核細(xì)胞培養(yǎng)7 d后，常規(guī)消化收集細(xì)胞，加入1 mL Trizol試劑，采用相分離技術(shù)提取RNA，紫外分光光度法測定其在280 nm和260 nm處的吸光度，計(jì)算RNA濃度和純度（OD260/OD280，正常值為 1．7～2．0）。各組檢測基因反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GAPDH為內(nèi)參基因，引物（北京奧科鼎盛生物科技有限公司）如表1。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系、PCR擴(kuò)增體系以及反應(yīng)條件，依據(jù)說明書設(shè)定。反應(yīng)完成后進(jìn)行擴(kuò)增曲線和熔解曲線分析?；虮磉_(dá)量中檢測基因的初始模板量以2-△△Ct表示。

1.3.6 蛋白免疫印跡法（Western-blot）檢測Fas蛋白 收集髓核細(xì)胞，加入RIPA裂解液冰上裂解，細(xì)胞裂解后，微孔法測定蛋白濃度，沖洗后加熱，使蛋白變性，上樣、電泳后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，室溫封閉。加入適當(dāng)稀釋的一抗（Fas 1∶200，F(xiàn)asL 1∶100，Caspase-8 1∶100）,室溫下反應(yīng)1 h。加入相應(yīng)二抗，漂洗后，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)記錄結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20．0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，P＜0．05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 髓核細(xì)胞培養(yǎng)以及形態(tài)觀察 原代髓核細(xì)胞7 d后基本貼壁,細(xì)胞呈梭形。15 d后，細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期，見圖1。

圖1 接種7 d后的細(xì)胞Fig.1 Cells inoculated for 7 days(×200)

2.2 髓核細(xì)胞的鑒定 番紅-O染色和甲苯胺藍(lán)染色均為陽性，表明細(xì)胞可以分泌蛋白多糖和糖胺多糖，見圖 2、圖 3。

圖2 髓核細(xì)胞番紅-O染色(×200)Fig.2 Red-O staining of nucleus pulposus cells(×200)

圖3 髓核細(xì)胞甲苯胺藍(lán)化學(xué)染色(×200)Fig.3 Toluidinebluestainingofnucleuspulposuscells(×200)

表 1 Fas、FasL、Caspase-8、GAPDH 基因引物Tab.1 Fas、FasL、Caspase-8、GAPDH primer

2.3 MTT法檢測柚皮苷抑制人髓核細(xì)胞凋亡的最佳濃度 對照組吸光度為（0．26±0．02），與對照組相比，20 μg/mL柚皮苷組吸光度明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01），而 40、80 μg/mL 柚皮苷組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。與20μg/mL柚皮苷組比較，40、80μg/mL柚皮苷組吸光度明顯降低（P＜0．01）。80 μg/mL 柚皮苷組吸光度值無明顯差異（P＞0．05)。見表2。

表2 MTT法檢測柚皮苷抑制人髓核細(xì)胞凋亡（x±s）Tab.2 MTT assay of naringin to inhibit the apoptosis of human nucleus pulposus cells（x±s）

2.4 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率 對照組細(xì)胞凋亡率為（12．48±1．38）%，加入不同濃度柚皮苷后，凋亡率均下降，與對照組相比，20、40 μg/mL柚皮苷組抑制細(xì)胞凋亡具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），其中20 μg/mL 柚皮苷對細(xì)胞凋亡抑制最明顯（P＜0．01），與 20 μg/mL 柚皮苷組比較，40、80 μg/mL 柚皮苷組細(xì)胞凋亡率較高（P＜0．01）。另外，40 μg/mL 柚皮苷組優(yōu)于 80 μg/ml柚皮苷組（P＜0．05），見表 3、圖 4。根據(jù)MTT與流式細(xì)胞的篩選結(jié)果采用20 μg/mL的柚皮苷，定為實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

表3 對照組與不同濃度柚皮苷組抑制人退變髓核細(xì)胞凋亡率（x±s）Tab.3 Control group and naringin group with different concentrations inhibit the apoptosis rate of human degeneration nucleus pulposus cells（x±s）

2.5 qRT－PCR 檢測 Fas、FasL、Caspase-8 基因表達(dá)情況 20 μg/mL柚皮苷組比對照組可以明顯抑制Fas、FasL、Caspase-8 基因的表達(dá)（P＜0．01）。柚皮苷組與對照組對于各個(gè)基因表達(dá)的影響，見表4。

3 討論

圖4 各組抑制人退變髓核細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞圖片F(xiàn)ig.4 Flow cytometry in each group to inhibit the apoptosis of degenerative nucleus pulposus cells

圖 5 Western-blot檢測 Fas、FasL、Caspase-8 蛋白表達(dá)Fig.5 Western-blot detection of Fas,FasL and Caspase-8 protein expression

表4 qRT-PCR檢測相關(guān)凋亡基因（x±s）Tab.4 qRT-PCR detection of related apoptotic genes（x±s）

腰椎間盤髓核組織主要由髓核細(xì)胞、蛋白多糖、糖胺多糖Ⅰ、Ⅰ型和Ⅱ型膠原及水分構(gòu)成。成人髓核細(xì)胞為類軟骨細(xì)胞，主要分泌蛋白多糖、糖胺多糖、Ⅱ型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)[3]。隨著髓核細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞外基質(zhì)含量下降，水分減少，椎間盤退變趨勢明顯增加。而細(xì)胞外基質(zhì)的減少會進(jìn)一步加劇髓核細(xì)胞的凋亡，形成惡性循環(huán)，腰椎間盤退變?nèi)遮吋又豙4]。本實(shí)驗(yàn)采用人退變椎間盤髓核組織，分離培養(yǎng)其細(xì)胞，番紅O染色陽性顯示細(xì)胞分泌蛋白多糖，甲苯胺藍(lán)染色陽性說明細(xì)胞可以分泌Ⅱ型膠原，證明此為髓核類軟骨細(xì)胞。

腰椎間盤退變中醫(yī)屬“腰痹”范疇，病機(jī)主要為肝腎虧虛，筋脈失養(yǎng)。中藥骨碎補(bǔ)具有補(bǔ)腎壯骨、續(xù)傷止痛的作用，常用于腰椎間盤退變的治療。柚皮苷是黃酮類物質(zhì)，是中藥骨碎補(bǔ)主要單體成分之一，具有抗炎、抗氧化、促進(jìn)骨形成、抑制骨破壞、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生及修復(fù)等作用[5]。有研究顯示，柚皮苷能有效地促進(jìn)人退變髓核細(xì)胞的增殖，提高細(xì)胞活性，這可能與其促進(jìn)髓核細(xì)胞蛋白多糖、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）的表達(dá)，抑制腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、SOX6和基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）的表達(dá)相關(guān)[6-7]。本實(shí)驗(yàn)通過MTT法和流式細(xì)胞法檢測20 μg/mL柚皮苷為抑制人髓核細(xì)胞凋亡的最佳濃度，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致，并用此濃度柚皮苷進(jìn)行相關(guān)基因及蛋白檢測。

細(xì)胞凋亡，又稱程序化細(xì)胞死亡，是由基因調(diào)控的細(xì)胞主動死亡過程[8]。其凋亡途徑主要有3條：死亡受體復(fù)合體通路（膜受體通路）、線粒體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路。死亡受體通路主要包括TNFR途徑、TRAIL途徑、Fas/FasL途徑。細(xì)胞凋亡可能通過Fas/FasL系統(tǒng)觸發(fā)死亡信號復(fù)合體介導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)。死亡受體通路中，F(xiàn)as與FasL結(jié)合后，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體，啟動Caspase-8/Caspase-10，可以通過Bid等細(xì)胞因子轉(zhuǎn)導(dǎo)，或直接激活凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3等，完成細(xì)胞凋亡[9-10]。qRT-PCR結(jié)果顯示柚皮苷組可以下調(diào)Fas、FasL、Caspase-8基因表達(dá)，Western-blot結(jié)果顯示柚皮苷可以抑制Fas蛋白表達(dá)，說明柚皮苷可能通過調(diào)控Fas/FasL死亡受體通路，抑制髓核細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，柚皮苷可能通過調(diào)控Fas/FasL死亡受體通路抑制人髓核細(xì)胞凋亡，為臨床治療腰痛提供新的途徑。但是柚皮苷抑制髓核細(xì)胞凋亡機(jī)制較為復(fù)雜，是否還通過其他途徑，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。相信隨著椎間盤退變研究的逐步深入，對其退變機(jī)制認(rèn)識逐漸深刻，會有更多、更有效的治療手段服務(wù)于廣大患者。

[1] Nianhu L,Camden W,Zhanwang X,et al.Therapeutic effects of naringin on degenerative human nucleus pulposus cells for discogeniclowbackpain[J].TheSpineJournal,2016,16(10):1231-1237.

[2] 朱慧鋒,王唯佳,王珠美.骨碎補(bǔ)研究進(jìn)展[J].中國骨傷,2009,22(1):66-67.

[3] Samartzis D,Borthakur A,Belfer I,et al.Novel diagnostic and prognostic methods for disc degeneration and low back pain[J].Spine J,2015,15(9):1919-1932.

[4] Wang F,Cai F,Shi R,et al.Aging and age related stresses:a senescencemechanismofintervertebraldiscdegeneration[J].Osteoarthritis Cartilage,2016,24(3):398-408.

[5] Nyane NA,Tlaila TB,Malefane TG,et al.Metformin-like antidiabetic,cardio-protective and non-glycemic effects of naringenin:Molecular and pharmacological insights[J].Eur J Pharmacol,2017,80(15):103-111.

[6] 翟遠(yuǎn)坤,牛銀波,潘亞磊,等.柚皮苷對體外培養(yǎng)乳鼠顱骨成骨細(xì)胞增殖和分化成熟的影響[J].中國中藥雜志.2013,38(1):105-111.

[7] 李風(fēng)波,孫曉雷,馬劍雄,等.柚皮苷對破骨細(xì)胞分化的影響[J].中國中藥雜志,2015,40(2):308-312.

[8] 趙彥超,顧 耘.細(xì)胞凋亡通路研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，2013,41(4):285-288.

[9]Calmon-Hamaty F,Audo R,Combe B,et al.Targeting the Fas/FasL system in Rheumatoid Arthritis therapy:Promising or risky[J].Cytokine,2015,75(2):228-233.

[10]Sun Z,Wan ZY,Guo YS,et al.FasL on human nucleus pulposus cells prevents angiogenesis in the disc by inducing Fas-mediated apoptosis of vascular endothelial cells[J].Int J Clin Exp Pathol,2013,6(11):2376-2385.