小瓜蟲在澳洲龍紋斑鰓器官上的分布及其影響

任麗花， 羅土炎， 劉 洋， 羅 欽， 饒秋華, 翁伯琦福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所/福建省精密儀器農(nóng)業(yè)測試重點實驗室，福建 福州 350003； 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，福建 福州 35003

澳洲龍紋斑M(jìn)accullochellapeeliiMitchll俗稱墨瑞鱈、澳洲鱈鱸等，是一種優(yōu)質(zhì)鱈鱸屬淡水魚類，原產(chǎn)于澳大利亞，是澳大利亞最大的純淡水魚，也是世界上純淡水魚中最大的一種，為最頂級的白肉魚，有特殊的外型以及鮮美口感，在澳大利亞素有“國寶魚”美稱(Cooley & Rowland，1993； Selosse & Rowland，1990)。該魚自 2001 年引入中國大陸，經(jīng)過近 17年的養(yǎng)殖發(fā)展，在浙江、廣州、海南、江蘇、青島、福建等地逐步試養(yǎng)成功。本項目組自2014年開始澳洲龍紋斑的養(yǎng)殖實驗。通過對國內(nèi)澳洲龍紋斑養(yǎng)殖的幾家主要企業(yè)或科研單位進(jìn)行跟蹤調(diào)查，發(fā)現(xiàn)對澳洲龍紋斑威脅最大的病害為小瓜蟲病；經(jīng)多次反復(fù)感染，魚體鰓、皮膚和鰭密布由小瓜蟲與上皮組織增生形成的肉眼可見的白色孢囊，嚴(yán)重時可導(dǎo)致澳洲龍紋斑苗種2周內(nèi)全部死亡(郭松等，2012)。

小瓜蟲病是由寄生在魚體表面的多子小瓜蟲IchthyophthiriusmtltiflisD.所引起。多子小瓜蟲亦稱小瓜蟲，隸屬原生動物門寡膜纖毛綱膜口目凹口科小瓜蟲屬，常寄生在魚類的皮膚、鰭、鰓、頭、口腔及眼等處，形成的孢囊呈白色小點狀，肉眼可見，故所致疾病俗稱“白點病”。多子小瓜蟲在世界范圍內(nèi)分布廣泛，從歐亞大陸向北至北極圈附近都有分布。小瓜蟲對寄主的種類及年齡均無嚴(yán)格選擇性，分布很廣，尤其不流動的小水體、高密度養(yǎng)殖的幼魚及觀賞性魚類易被感染，給淡水魚養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失(Aboweietal.，2011； Malliketal.,2015)。

近幾十年來國內(nèi)外對小瓜蟲的研究多集中在其致病性、防治及組織病理方面(陸英杰等，2014； 羅欽等，2017； 羅土炎等，2015，2016； 倪達(dá)書和李連祥，1960； 王哲等，2016； 章海鑫等，2016)；但是少見小瓜蟲侵染宿主的掃描電鏡觀察，且對小瓜蟲病的病理報道主要集中在皮膚、鰓絲及眼等蟲體寄生的部位，有關(guān)鰓蓋的病理變化未見報道。小瓜蟲幼蟲在宿主身上發(fā)育成熟后脫離宿主，黏附到水底或池壁上，或水底的物體上。澳洲龍紋斑游動慢，喜底棲與附壁，所以其苗種極易感染小瓜蟲。本實驗就小瓜蟲侵染澳洲龍紋斑的鰓蓋、鰓絲及鰓小片的表面形態(tài)變化情況進(jìn)行研究，以期能豐富小瓜蟲的致病性及病理學(xué)方面的研究內(nèi)容，并為漁業(yè)生產(chǎn)中小瓜蟲病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用澳洲龍紋斑健康幼魚及感染小瓜蟲的幼魚均由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院邵武養(yǎng)殖基地提供。魚體大小基本一致，體長8～10 cm，平均體重(10±2) g。

1.2 方法

將帶回的澳洲龍紋斑幼魚培養(yǎng)1周后，進(jìn)行小瓜蟲感染, 感染前幼魚禁食24 h。選擇30尾健康的無小瓜蟲感染的魚養(yǎng)殖在50 L水族箱里，水族箱的水溫設(shè)置在24.5～27.0 ℃，每天水體交換率50%，配合飼料投餌率為魚體重的3%。將感染小瓜蟲的澳洲龍紋斑幼魚投放進(jìn)去,觀察魚身上是否出現(xiàn)白點，如有白點，將白點刮下，顯微鏡觀察到小瓜蟲蟲體即確定感染成功，在其感染嚴(yán)重時取樣，作為實驗組，以健康魚為對照組。

1.2.1 白點病病原確定方法 用吸管吸取適量滅菌水，輕輕沖洗去鰓絲上多余的黏液和血液，多次沖洗后，取患病魚的鰓絲放入無菌培養(yǎng)皿中并加水沒過，靜置5～10 min后，在室溫18 ℃的條件下，吸取少量病體置于凹玻片中，輕輕蓋上蓋玻片于顯微鏡下觀察。

1.2.2 掃描電鏡樣品制備方法 活體取鰓蓋、鰓小塊樣品，置于2.5%戊二醛溶液中4 ℃固定過夜，之后倒掉固定液，用0.1 mol·L-1、pH 7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品3次，每次15 min，之后用1%鋨酸溶液固定樣品1～2 h，倒掉固定液，用蒸餾水漂洗樣品3次，每次15 min；用梯度濃度(包括30%、50%、70%、80%、90%和95%等5種濃度)的乙醇溶液對樣品進(jìn)行脫水處理，每種濃度處理15 min，再用100%乙醇處理2次，每次20 min，然后用環(huán)氧丙烷處理2次，臨界點干燥，EIKO離子濺射儀鍍膜，處理好的樣品在JSM-6380LV型掃描電鏡中觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原確定

通過顯微鏡觀察到有持續(xù)旋動、圓形的大小為20～100 μm的纖毛蟲，可以確定寄生蟲為多子小瓜蟲(圖1)。

圖1 顯微鏡下澳洲龍紋斑鰓部的小瓜蟲Fig.1 Ichthyophthirius multifiliis on the gill of Maccullochella peelii under microscope

2.2 澳洲龍紋斑感染小瓜蟲的癥狀

在病魚的體表、鰭條、鰓上均發(fā)現(xiàn)有0.5～1.0 mm的白色小點狀凸起，個別重度病魚全身皮膚和鰭條布滿白點，全身體表如同覆蓋著一層白色薄膜。受害早期病魚體表和鰓絲黏液增多，體色暗淡無光，病魚消瘦，且沿池邊游動；受害較為嚴(yán)重的澳洲龍紋斑鰓絲潰爛，體表紅腫、潰爛，有爛鰭及機械摩擦損傷的痕跡，病魚多呈浮頭狀漂浮于水面不游動或緩慢游動。用載玻片刮取病魚尾鰭或體表白點涂片，可發(fā)現(xiàn)小瓜蟲成蟲在活動。

2.3 健康澳洲龍紋斑鰓絲及鰓蓋的掃描電鏡觀察

由圖2可見，健康澳洲龍紋斑鰓絲呈梳狀整齊排列，鰓絲表面由單層扁平上皮細(xì)胞覆蓋，表面有少許黏液組織，鰓絲頂端的鰓小片結(jié)構(gòu)清晰(圖2A)。呈書頁狀排列在鰓絲上的2列鰓小片間隔等距離，鰓小片厚4～10 μm，間距為10～40 μm，鰓小片表面呈褶皺狀、凹凸不平，但基本結(jié)構(gòu)保持完整(圖2B-D)；同時，在鰓絲和鰓小片上存在各種復(fù)雜的環(huán)形微嵴、溝狀或坑狀凹陷以及孔洞等結(jié)構(gòu)(圖2E-F)。由圖3可知，健康澳洲龍紋斑鰓蓋表面較光滑(圖3A)，鰓蓋骨表面可見疏松排列的膠原纖維束(圖3C)，且在礦化的膠原蛋白束之間有大量孔洞，孔的直徑從幾微米到幾十微米不等(圖3B，D)。

圖2 健康澳洲龍紋斑鰓絲及鰓小片的掃描電鏡觀察Fig.2 Scanning electron microscope observation of gill-filaments and gill-lamella of healthy Murray cod, Maccullochella peelii A：鰓絲整體觀；B：鰓絲末端；C：鰓絲及鰓小片；D：鰓小片；E：微嵴；F：鰓上皮細(xì)胞及孔洞。A： Total view of gill-filaments; B： The end of gill-filaments; C： Gill-filaments and gill-lamella; D： Gill-lamella; E： Microridge; F： Gill epithelial cells and pores.

2.4 澳洲龍紋斑被小瓜蟲侵染后鰓絲、鰓小片及鰓蓋的掃描電鏡觀察

對實驗組的澳洲龍紋斑鰓絲、鰓小片及鰓蓋的表面形態(tài)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)重度感染小瓜蟲的澳洲龍紋斑鰓絲出現(xiàn)一定程度的膨脹變形，鰓絲小骨裸露變形，頂端充血(圖4A-C)，鰓絲表層單細(xì)胞增生，結(jié)構(gòu)粗糙(圖4C,J)，還有的鰓絲出現(xiàn)斷裂(圖4L)。鰓小片上皮細(xì)胞腫大(圖4B,K)，末端呈球狀或棒狀,表層單細(xì)胞也有增生現(xiàn)象，結(jié)構(gòu)變得粗糙(圖4H,K)，鰓小片脫落(圖4G)、缺失甚至斷裂，呈現(xiàn)不完整狀態(tài)(圖4I)，鰓小片間距縮小甚至黏連，鰓小片結(jié)構(gòu)消失(圖4I,K)。另外，鰓絲及鰓小片的表皮組織明顯增厚，形成明顯的凸起。鰓蓋骨的內(nèi)表皮腫脹變形，黏液細(xì)胞增多，孔洞明顯減少(圖4M-O)。同時，鰓絲、鰓小片及鰓蓋上的黏液細(xì)胞分泌增多(圖4D，N)。

2.5 侵染后期小瓜蟲在澳洲龍紋斑鰓絲及鰓蓋上的分布情況

實驗組的澳洲龍紋斑可見小瓜蟲寄生于鰓的扁平上皮細(xì)胞之下以及鰓絲表面、鰓絲邊緣和間隙中，鰓小片之間分布較少(圖5A-D)。在鰓蓋上的分布最多，大多數(shù)藏在黏液細(xì)胞、膠原纖維束的下面，在斷裂的鰓蓋細(xì)胞的間隙里也有小瓜蟲分布(圖5E-I)。小瓜蟲的大小20～100 μm不等，呈扁平狀或馬蹄狀，有的小瓜蟲的纖毛上沾滿了黏液組織或血紅細(xì)胞，尤其鰓蓋上，黏液細(xì)胞里面包裹著許多小瓜蟲。

3 討論

3.1 小瓜蟲對澳洲龍紋斑鰓部的影響

魚類鰓的主要功能是呼吸，其呼吸運動主要是依靠鰓節(jié)肌的收縮，造成口的開關(guān)及鰓蓋的擴(kuò)張與收縮以促使水的通入與流出。魚在水中時，每個鰓片、鰓絲、鰓小片都完全張開，使鰓和水的接觸面積擴(kuò)大，增加攝取水中溶解氧的機會。鰓小片中有微血管，其表皮很薄，當(dāng)血液流過這里時就完成了氣體交換：將帶來的二氧化碳透過鰓小片的薄壁，送到水中；同時吸取水中的氧，氧隨血液循環(huán)輸送到身體各部分。口部和鰓蓋的交替開閉，可以使水不斷地由口進(jìn)入口腔，經(jīng)咽到達(dá)鰓腔，與鰓絲接觸，然后由鰓孔排到外面，魚類的呼吸作用就是在這個過程中完成的(吳志強，1993)。此外，鰓還具有排泄氮代謝廢物和參與滲透壓調(diào)節(jié)的重要功能(王哲等，2016)。本實驗中，由于小瓜蟲的寄生，澳洲龍紋斑鰓絲、鰓小片及鰓蓋均出現(xiàn)一定程度的腫脹變形，鰓小片末端膨大甚至黏連融合在一起，鰓小片的主要功能是氣體交換，腫脹變形加上黏液的堆積影響了澳洲龍紋斑鰓部器官的正常功能，造成血液循環(huán)受阻、滲透壓調(diào)節(jié)失衡，最終導(dǎo)致魚體缺氧死亡。

不少學(xué)者對魚類黏液細(xì)胞的作用及其分泌物的存在部位和形態(tài)特征進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)分泌的黏液不僅可為水的微循環(huán)提供適宜的表面，而且可以保護(hù)其覆蓋的結(jié)構(gòu)不受機械損傷。本實驗中，澳洲龍紋斑感染小瓜蟲后鰓絲、鰓小片及鰓蓋上黏液分泌增多且各組織明顯增厚，可見，受到刺激后由于黏液薄膜極易破裂，迅速排出大量黏液，以減少鰓絲的損傷，此特點與白甲魚Onychostomasima、鰱魚Hypophthalmichthysmolitrix、鯽魚Carassiusauratus的情況相似(王志余和董雙林，1990; 鄭曙明和吳青，2005)。此外，從感染嚴(yán)重的澳洲龍紋斑的鰓絲、鰓小片及鰓蓋上觀察到小瓜蟲的纖毛上沾滿了黏液細(xì)胞及血紅細(xì)胞，且小瓜蟲被包裹在黏液細(xì)胞中。在生活史的某一階段，利用纖毛或纖毛器作為運動和攝食的細(xì)胞器是纖毛蟲最基本的特點，所以黏液的增多在一定程度上限制了小瓜蟲的運動及營養(yǎng)吸收，是澳洲龍紋斑應(yīng)對外來傷害的一種應(yīng)激反應(yīng)。

圖4 澳洲龍紋斑被小瓜蟲侵染后鰓絲、鰓小片及鰓蓋的掃描電鏡觀察Fig.4 Scanning electron microscope photographs of gill-filaments, gill-lamella and operculum of Maccullochella peeliiby infected by Ichthyophthirius multiflisA:鰓絲整體觀；B:腫脹的鰓絲末端；C:鰓絲表面；D:黏液布滿鰓絲的表面；E:鰓絲表面的黏液；F:鰓絲表面的血紅細(xì)胞；G:鰓小片缺失；H:鰓小片末端膨大；I:鰓小片缺失、變形；J:鰓絲表層單細(xì)胞增生；K:鰓小片增生；L:斷裂的鰓絲；M:鰓蓋上的膠原纖維；N: 鰓蓋上的黏液；O:鰓蓋腫脹。A: The overall view of the silk; B: The swollen ends of the gill; C: The surface of gill-filaments; D: The surface of the gill-filaments covered with mucus; E: The mucus on the surface of gill-filaments; F: Red blood cells on the surface of the gill-filaments; G: The gill-lamella missing; H: The ends of the gill-lamella expanded; I: Loss and deformation of gill-lamella; J: The proliferation of single-cell surface; K: The proliferation of the gill-lamella; L: The broken gill-filaments; M: Collagen on the operculum; N: The mucus on the operculum; O: The lid is swollen.

圖5 小瓜蟲在澳洲龍紋斑鰓上的分布情況Fig.5 The distribution of Ichthyophthirius multiflis on the gills of the Murray cod, Maccullochella peeliiA:寄居在鰓絲扁平上皮細(xì)胞之下；B:在鰓絲表面；C:在鰓絲之間；D:在鰓小片間；E:在鰓蓋上；F:在鰓蓋上皮細(xì)胞之下；G:包裹在鰓蓋上的黏液細(xì)胞里；H:在鰓蓋的斷裂截面里；I:在鰓蓋表面。A： I. multifiliisa under the flat epithelial cells of the gill-filament; B: On the surface of the gill-filament; C: Among the gill-filaments; D: Among the gill-lamella; E: On the operculum; F: Under the epithelial cells of the operculum; G: Parceled in the mucus cell on the operculum; H: In the fracture section of the operculum; and I: On the surface of the operculum.

3.2 侵染后期小瓜蟲在澳洲龍紋斑鰓上的分布情況

以往的研究多發(fā)現(xiàn)小瓜蟲主要寄生在鰓絲及鰓小片上，有關(guān)鰓蓋上寄生的報道極少,可能學(xué)者們在研究小瓜蟲的時候，習(xí)慣性地只觀察鰓絲而忽略了鰓蓋。本研究發(fā)現(xiàn)，侵染后期寄生在澳洲龍紋斑鰓蓋上的小瓜蟲的數(shù)量明顯多于鰓絲及鰓小片上的數(shù)量。這可能是由于侵染后期鰓絲及鰓小片的腫脹變形甚至鰓小片的黏連成片，再加上黏液分泌的增多，不適宜小瓜蟲的活動，致使其遷移至活動范圍相對較大的鰓蓋上。這一結(jié)果應(yīng)該在以后的研究中引起重視，需進(jìn)一步驗證。

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