姚亞林，陳祥盛，楊 琳*

(1.貴州大學(xué) 林學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué) 昆蟲資源開(kāi)發(fā)利用省級(jí)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州大學(xué) 昆蟲研究所，貴州 貴陽(yáng) 550025；4.貴州大學(xué) 貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲害省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

葉蟬類昆蟲均屬植食性，不僅刺吸危害植物，而且其刺吸式口器刺吸植物汁液，影響植物的正常發(fā)育；取食產(chǎn)卵過(guò)程造成的植物傷痕影響水分和養(yǎng)分運(yùn)輸；通過(guò)交叉寄主傳播植物病毒；排泄物蜜露堵塞植物氣孔影響光合作用；分泌物可為多種霉菌提供培養(yǎng)基導(dǎo)致霉病爆發(fā)，是農(nóng)、林、果樹(shù)及經(jīng)濟(jì)植物的重要害蟲類群之一。

柔突葉蟬屬AbrusDaietZhang，2002屬半翅目Hemiptera，葉蟬科Cicadellide，角頂葉蟬亞科Deltocephalinae。該屬目前已知19種[1]，分別為：安龍柔突葉蟬A.anlongensisChen，Yang Li，2012；竹柔突葉蟬A.bambusanusChen，Yang Li，2012；叉莖柔突葉蟬A.bifurcatusDai Zhang，2002；雙枝柔突葉蟬A.biprocessusLi，2011；短板柔突葉蟬A.breviolusDai Zhang，2008；短莖柔突葉蟬A.brevisDai Zhang，2002；凹板柔突葉蟬A.concavelusLi Wang，2006；錐尾柔突葉蟬A.coneusDai Zhang，2002；大明山柔突葉蟬A.damingshanensisXing Li，2014；道真柔突葉蟬A.daozhenensisChen，Yang Li，2012；寬頂側(cè)突柔突葉蟬A.expansivusXing Li，2014；細(xì)莖柔突葉蟬A.graciaedeagusLi，2011；衡山柔突葉蟬A.hengshanensisDai Zhang，2002；黃氏柔突葉蟬A.huangiDai Zhang，2002；崀山柔突葉蟬A.langshanensisYang & Chen，2013；雷公山柔突葉蟬A.leigongshanesisLi Wang，2006；武夷柔突葉蟬A.wuyiensisDai Zhang，2002；習(xí)水柔突葉蟬A.xishuiensisYang Chen，2013；云山柔突葉蟬A.yunshanensisChen, Yang Li，2012分布于東洋界和古北界。除叉莖柔突葉蟬大明山柔突葉蟬寬頂側(cè)突柔突葉蟬和武夷柔突葉蟬4個(gè)種外，其余14種均報(bào)道危害竹子。該屬形態(tài)結(jié)構(gòu)相似，且部分種的雄性外生殖器結(jié)構(gòu)差異程度不大，這對(duì)該類昆蟲的物種鑒定帶來(lái)了困難。

目前，研究近似種最有效的方法是結(jié)合形態(tài)和分子數(shù)據(jù)進(jìn)行分類鑒定。關(guān)于葉蟬科的分子鑒定方面，一些類群如角頂葉蟬類Deltocephalus-like，彎鉤葉蟬屬Flexamia，黃翅葉蟬屬Dalbulus的16S rRNA基因序列片段可用于區(qū)分近緣種[2-3]，然而有些類群如緬甸安小葉蟬Anakaburmensis，COI基因也具有相當(dāng)?shù)蔫b定功效[4-5]，可見(jiàn)不同動(dòng)物類群的最適條形碼并非一致。在葉蟬類昆蟲的DNA條形碼研究中，相比于COI基因，16S rRNA基因序列片段較易擴(kuò)增，常被作為一種有效的分子標(biāo)記，用于區(qū)分形態(tài)近似種或描述新發(fā)現(xiàn)的種類[6-10]，然而，柔突葉蟬屬的分子鑒定相關(guān)研究尚未有報(bào)道。為此，本文提取擴(kuò)增了采自竹類的柔突葉蟬屬5個(gè)近似種(錐尾柔突葉蟬、道真柔突葉蟬、習(xí)水柔突葉蟬、安龍柔突葉蟬和短莖柔突葉蟬，圖A1-E5)COI序列片段，對(duì)其進(jìn)行分子鑒定，同時(shí)利用鄰接法(NJ)、最大簡(jiǎn)約MP法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并結(jié)合形態(tài)結(jié)構(gòu)與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)對(duì)其近緣種的物種分化時(shí)間估計(jì)進(jìn)行分析和討論，以期為角頂葉蟬亞科的分類學(xué)和系統(tǒng)學(xué)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用標(biāo)本的采集信息詳見(jiàn)表1，錐尾柔突葉蟬、道真柔突葉蟬、習(xí)水柔突葉蟬、安龍柔突葉蟬和短莖柔突葉蟬的外部形態(tài)特征及雄性外生殖器如圖1、圖2。樣品冷凍保存于貴州大學(xué)昆蟲研究所，雄性外生殖器保存于甘油中，以備查用。5種近緣柔突葉蟬的外部形態(tài)[11]如圖1，其雄性陽(yáng)莖如圖2。

1.2 試劑及儀器

昆蟲DNA提取試劑盒購(gòu)于Omega BioTek公司(D0926-01)；引物由生物工程(上海)股份有限公司合成。Olympus SZ2-ILST型光學(xué)體視顯微鏡(德國(guó)Leica公司)；T100TMThermal Cycler型PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)BIO-RAD公司)；170-8170 型 UVP 凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó) BIO-RAD 公司)；Power PacTMHV Power Supply型電泳儀(美國(guó)BIO-RAD公司)；Mini-10K微型高速離心機(jī)(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司)；HVE-50型自動(dòng)高壓滅菌器(日本HIRAYAMA制造公司)等。

表1 供試?yán)ハx的采集信息Tab.1 Collecting information for the insect specimens

A1- A3：安龍柔突葉蟬A.anlongensis；B1- B3：短莖柔突葉蟬A.brecis；C1- C3：錐尾柔突葉蟬A.coneus；D1- D3：習(xí)水柔突葉蟬A.xishuiensis；E1- E3：道真柔突葉蟬A.daozhenensis

圖1 柔突葉蟬屬5個(gè)近似種成蟲背面、顏面及頭胸側(cè)面觀
Fig. 1 Habitus of five similar species ofAbrus

A4- A5：安龍柔突葉蟬A.anlongensis；B4- B5：短莖柔突葉蟬A.brecis；C4- C5：錐尾柔突葉蟬A.coneus；D4- D5：習(xí)水柔突葉蟬A.xishuiensis；E4- E5：道真柔突葉蟬A.daozhenensis

圖2 柔突葉蟬屬5個(gè)近似種雄性外生殖器特征
Fig. 2 Morphology of male external genitals of five similar species ofAbrus

1.3 DNA提取及PCR擴(kuò)增

冷凍保存標(biāo)本解凍后，將腹部放入甘油中保存，剩余的蟲體取頭胸足等部分研磨至粉末狀，然后用Omega BioTek公司生產(chǎn)的E.Z.N.A.TMInsect DNA kit試劑盒提取總DNA，產(chǎn)物-20℃保存。

PCR上下游擴(kuò)增引物參照Folmer等[5]設(shè)計(jì)，COI片段引物為：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3′；5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAAT-3′。PCR反應(yīng)體系為30 μL，其中模板DNA 3 μL，上下游引物各1 μL、Taq PCR Master Mix 15 μL、ddH2O補(bǔ)至30 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，33個(gè)循環(huán)，最后72℃補(bǔ)償延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物取，3 μL采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，純化步驟參照DNA凝膠回收試劑盒Omega BioTek公司(D0926-01)程序?；厥债a(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

將獲得的測(cè)序峰圖利用DNAstar 5.0軟件進(jìn)行正反鏈校對(duì)和編輯，手動(dòng)去除序列兩端的引物區(qū)，獲得有效片段的樣本序列。Meglign進(jìn)行排序后利用Clustal X進(jìn)行多序列比對(duì)，采用DnaSP v5計(jì)算信息位點(diǎn)、變異位點(diǎn)數(shù)，通過(guò)MEGA 6.06分析堿基組成、變異位點(diǎn)，并基于Kimura-2-parameter(K2P)模型進(jìn)行遺傳距離分析，并以叉突平額葉蟬Flatfrontapronga為外群，采用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ法)和最大簡(jiǎn)約法(MP法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的節(jié)點(diǎn)支持率采用自展值進(jìn)行估計(jì)，重復(fù)檢驗(yàn)1000次。同時(shí)結(jié)合貝葉斯方法BPP[12-15]和MCMCTREE[16]對(duì)這5個(gè)近緣種的物種分化時(shí)間進(jìn)行討論。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿基組成及序列變異

利用MEGA 6. 06軟件對(duì)本研究中獲得的COI基因序列進(jìn)行比對(duì)后，保留622 bp的同源性序列，對(duì)其分析結(jié)果顯示：COI序列中，A、T、G、C含量分別是30.5% 、36.8% 、14.7% 、18.0%，A+ T的平均含量為67.3%，G + C的平均含量為32.7%；共檢測(cè)到保守位點(diǎn)407個(gè)，變異位點(diǎn)215個(gè)，簡(jiǎn)約信息點(diǎn)90個(gè)，自裔位點(diǎn)125個(gè)，變異位點(diǎn)約占總序列的34.56%。

2.2 遺傳距離

利用MEGA 6.06軟件計(jì)算不同個(gè)體的COI基因序列間的遺傳距離(不同模型下的遺傳距離，表3) 。習(xí)水柔突葉蟬與道真柔突葉蟬種間的遺傳距離最小為0.011，錐尾柔突葉蟬與道真柔突葉蟬遺傳距離最大為0.095。柔突葉蟬屬與平額葉蟬屬間的遺傳距離為0.69～0.96。從不同模型下的遺傳距離 (表3～7) 可以看出，K2P轉(zhuǎn)換+G遺傳距離與Pdistance+U遺傳距離模型下短莖柔突葉蟬與安龍柔突葉蟬種間遺傳距離最小為0.011，最大為0.103～0.335，此時(shí)從遺傳距離界定這兩種較困難。錐尾柔突葉蟬和道真柔突葉蟬間遺傳距離在K2P轉(zhuǎn)換+顛換+G模型下最大，為0.367，而在JC69 +Gamma模型下為0.366，Pdistance+U遺傳距離最小為0.095。表明轉(zhuǎn)換與顛換以及位點(diǎn)的替代速率分布的異質(zhì)性較強(qiáng)，對(duì)遺傳距離的估計(jì)影響較大，利用COI基因序列間遺傳差異來(lái)鑒定柔突葉蟬效率不太高，總體來(lái)說(shuō)，COI基因序列可以暫時(shí)被作為該屬近緣種分子鑒定的候選基因序列片段。

表3 供試5種柔突葉蟬COI基因序列的Pdistance遺傳距離Tab.3 Genetic distances under the Pdistance model of COI sequence of five Abrus species

注：右上半三角部分為遺傳距離的標(biāo)準(zhǔn)誤S.E，下同。

表4 供試5種柔突葉蟬COI基因序列的JC69+G遺傳距離Tab.4 Genetic distances under the JC69+U model of COI sequence of five Abrus species

表5 供試5種柔突葉蟬COI基因序列的JC69+U遺傳距離Tab.5 Genetic distances under the K2P+Ts+Tv+G model of COI sequence of five Abrus species

表6 供試5種柔突葉蟬COI基因序列的K2P轉(zhuǎn)換+顛換+G遺傳距離Tab.6 Genetic distances under the K2P+Ts +G model of COI sequence of five Abrus species

表7 供試5種柔突葉蟬COI基因序列的K2P轉(zhuǎn)換+G遺傳距離Tab.7 Genetic distances under the K2P+Ts +G model of COI sequence of five Abrus species

表8 供試5種柔突葉蟬COI基因序列的K2P轉(zhuǎn)換+U遺傳距離Tab.8 Genetic distances under the K2P+Ts +U model of COI sequence of five Abrus species

2.3 堿基替換飽和度分析

本研究使用F84遺傳距離對(duì)數(shù)據(jù)組進(jìn)行了替換飽和分析，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)換(S)與顛換(V)的比率均隨著遺傳距離的增加而上升，顛換逐漸多于轉(zhuǎn)換，與線粒體基因中堿基CT及AG突變較多的情況相吻合。轉(zhuǎn)換與顛換的曲線均呈現(xiàn)出向平臺(tái)期過(guò)渡的趨勢(shì)，即出現(xiàn)飽和狀態(tài)的傾向。整體而言，盡管序列整體上較為保守，但構(gòu)建的數(shù)據(jù)集飽和度在較低的水平上，說(shuō)明作為常用的分子標(biāo)記，COI基因包含足夠的遺傳信息可以用于解析本研究所構(gòu)建數(shù)據(jù)集的分類關(guān)系(圖3)。

表9 供試5種柔突葉蟬COI基因序列的Pdistance+U遺傳距離Tab.9 Genetic distances under the Pdistance+U model of COI sequence of five Abrus species

橫坐標(biāo)：F84模型下的遺傳距離；縱坐標(biāo)：轉(zhuǎn)換和顛換值

圖3 序列堿基替換飽和度分析
Fig.3 Transitions (s) and transversions (v) versus divergences by COI sequences.

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

以叉突平額葉蟬為外群，基于COI構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中(圖4、5)，得到了一致的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，并得到了較高的檢驗(yàn)支持率。道真柔突葉蟬和習(xí)水柔突葉蟬的3個(gè)種聚為一支，與安龍柔突葉蟬形成姐妹群關(guān)系，短莖柔突葉蟬和錐尾柔突葉蟬位于較根部，其中道真柔突葉蟬與習(xí)水柔突葉蟬親緣關(guān)系最近，而其與錐尾柔突葉蟬和短莖柔突葉蟬親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。基于貝葉斯方法的BPP物種定界與物種樹(shù)估計(jì)的結(jié)果(圖6)也表明錐尾柔突葉蟬與道真柔突葉蟬的親緣關(guān)系遠(yuǎn)，盡管它們的形態(tài)極為相近，但COI構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中并未按屬聚一簇，其單系性并不明確。

MCMCTREE的估計(jì)結(jié)果中(圖7)，短莖柔突葉蟬、錐尾柔突葉蟬、道真柔突葉蟬與習(xí)水柔突葉蟬三種在系統(tǒng)樹(shù)中的關(guān)系與BPP的一致，但其三物種的最近共同祖先(most recent common ancestor，MRCA)分化時(shí)間比BPP估計(jì)的高，道真柔突葉蟬與習(xí)水柔突葉蟬的分化時(shí)間約為4-10ka BP左右,而錐尾柔突葉蟬和道真柔突葉蟬+習(xí)水柔突葉蟬+安龍柔突葉蟬+錐尾柔突葉蟬的MRCA分化時(shí)間約120 ka BP，都是處于全新世初，冰后期。錐尾柔突葉蟬位于根部，這也與其常見(jiàn)寄主差異有關(guān)，錐尾柔突葉蟬常見(jiàn)的寄主并非方竹，而是平竹，故在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中體現(xiàn)出與其他柔突葉蟬的差異而出現(xiàn)在根部。

圖4 Abrus 5個(gè)近緣種的COI 基因序列進(jìn)化樹(shù)(NJ tree)

Fig.4 eighbor-joining (NJ) analysis of Kimura-2-parameter (K2P) distances of fiveAbrusspecies. Values above the branches are NJ bootstrap values (> 60%).

圖5 Abrus 5個(gè)近緣種的COI基因序列進(jìn)化樹(shù)(MP tree)

Fig.5 Strict consensus phylogenetic tree based on maximum parsimony (MP) analysis of fiveAbrusspecies. Values above the branches are MP bootstrap values (> 60%).

圖6 Abrus 5個(gè)近緣種的BPP物種定界

與物種樹(shù)估計(jì)的最優(yōu)結(jié)果

Fig.6 The optimal results of species delimitation and species tree estimation by BPP of fiveAbrusspecies

圖7 Abrus 5個(gè)近緣種的MCMCTREE物種分化時(shí)間估計(jì)

Fig.7 Species divergence time of the fiveAbrusspecies by MCMCTREE software

3 結(jié)論與討論

目前已知柔突葉蟬Abrus共19種，全部分布于中國(guó)，其形態(tài)相似度高，且大部分寄主為竹類。本研究的5種柔突葉蟬的寄主有貴州都勻斗篷山特有的毛環(huán)方竹Chimonobambusahirtinoda分布，習(xí)水的方竹Chimonobambusaangustifolia以及寬闊水有分布的平竹Qiongzhueacommunis和一些其他的方竹，由寄主的獨(dú)有性以及柔突葉蟬在世界分布來(lái)看，尤其是該屬與方竹共有特有區(qū)的分布特點(diǎn)來(lái)看，該屬似乎與竹類的進(jìn)化有較強(qiáng)的協(xié)同性，但其實(shí)際協(xié)同關(guān)系還待深入研究。

依據(jù)經(jīng)典分類方法利用雄性外生殖器的形態(tài)學(xué)特征對(duì)這5種柔突葉蟬進(jìn)行鑒定時(shí)，錐尾柔突葉蟬(C1～C3)與習(xí)水柔突葉蟬(D1～D3)道真柔突葉蟬(E1～E3)三者的雄性外生殖器也極為相似(表2)，使得在農(nóng)林生產(chǎn)實(shí)踐中基于形態(tài)學(xué)來(lái)區(qū)分這三物種較困難。本研究首次利用COI序列進(jìn)行分子鑒定，從遺傳距離來(lái)看，COI做分子鑒定是可行的，但在不同模型下的距離差異較大可能預(yù)示著當(dāng)樣本數(shù)量增大可能表現(xiàn)并不可觀，今后應(yīng)該結(jié)合其他基因片段評(píng)價(jià)其鑒定效率。同時(shí)，COI的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果表明錐尾柔突葉蟬和道真柔突葉蟬與習(xí)水柔突葉蟬存在很大差異。從形態(tài)來(lái)看，其主要區(qū)別不僅在于其翅的外觀色澤、顏面額唇基的飽滿度等特征等，而雄性外生殖器的連鎖形態(tài)、陽(yáng)莖端部的反向齒突也明顯不同，COI卻能很好的體現(xiàn)這些隱存的差異，F(xiàn)ang等[17]提出“Y”連鎖更具祖征的結(jié)論，本文中錐尾柔突葉蟬和道真柔突葉蟬及習(xí)水柔突葉蟬的連鎖卻差異較大，前者是Abrus中唯一一個(gè)主干較細(xì)的，其余均較粗大(表1)，因此出現(xiàn)COI的差異表現(xiàn)并不意外。

分子鑒定理想的條形碼種內(nèi)遺傳差異會(huì)小于近緣物種種間差異[18]，即種內(nèi)、種間遺傳差異的幅度確定了物種的界限[19]。若種內(nèi)、種間遺傳差異存在重疊，則說(shuō)明該分子標(biāo)記無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分物種。理論上，有效的DNA條形碼應(yīng)存在條形碼間隔，即種內(nèi)、種間遺傳距離差異明顯。Hebert等[20]提出，種間遺傳差異應(yīng)達(dá)到種內(nèi)遺傳差異的10倍。本研究所涉及種類的COI基因片段序列均有明顯條形碼間隔，未出現(xiàn)種內(nèi)、種間遺傳差異存在重疊的種群，證實(shí)了它們作為慈竹葉蟬類昆蟲DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因的可行性。盡管有研究表明角頂葉蟬類Deltocephalus-like，彎鉤葉蟬屬Flexamia，黃翅葉蟬屬Dalbulus 16S rRNA基因序列片段可用于區(qū)分近緣種[2-3]。但本文研究結(jié)果表明至少竹類柔突葉蟬的COI基因序列片段被作為一種有效的分子標(biāo)記，用于區(qū)分形態(tài)近似種。

COI基因的普遍替代速率從0.0168到0.023每個(gè)位點(diǎn)/每百萬(wàn)年[21-22]。真核生物的替代速率從0.00172到0.0258每個(gè)位點(diǎn)/每百萬(wàn)年[23-24]。昆蟲的16S或12S-16S的替代速率從0.005到0.011[22,25]。本研究使用COI的替代速率0.0168到0.023。從MCMCTREE估計(jì)的結(jié)果來(lái)看(圖7)，短莖柔突葉蟬、錐尾柔突葉蟬、道真柔突葉蟬與習(xí)水柔突葉蟬的分化時(shí)間約為4ka BP左右,而錐尾柔突葉蟬與道真柔突葉蟬與習(xí)水柔突葉蟬的祖先分化時(shí)間約16ka BP，都是處于全新世初，冰后期，但是估計(jì)結(jié)果偏低，這很可能與這些物種的分化早期出現(xiàn)過(guò)水平基因流或基因漸滲等復(fù)雜演歷程有關(guān)，而本文選擇的COI突變頻率的先驗(yàn)分布盡管是信息較少的先驗(yàn)，但是數(shù)據(jù)量少使得估計(jì)結(jié)果精度低。全新世至近期經(jīng)歷了多次的冷暖波動(dòng)[26]，植被的垂直帶譜逐漸完善的過(guò)程中，一些特殊的植物北移，如水青岡等，箭竹等高海拔植物下移[27]，而寬闊水國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)正好擁有水青岡-箭竹林群落，同時(shí)也具有錐尾柔突葉蟬與道真柔突葉蟬兩種柔突葉蟬昆蟲的分布，這兩種柔突葉蟬的生殖器明顯和貴州雷公山的安龍柔突葉蟬，以及貴州都勻斗篷山的短頸柔突葉蟬的陽(yáng)莖不同，而這三個(gè)地方的方竹自冰后期全新世以來(lái)，在經(jīng)歷分化并形成當(dāng)前的區(qū)系分布格局的進(jìn)程中，應(yīng)該對(duì)柔突葉蟬屬的分布格局產(chǎn)生重大影響，如果這推斷成立，那么從這種若隱若現(xiàn)而有趣的寄主-昆蟲多樣性聯(lián)系中可以深入分析柔突葉蟬類群的演化及協(xié)調(diào)進(jìn)化機(jī)制，不過(guò)今后還需進(jìn)一步結(jié)合該屬的更多的地理種群樣本從譜系地理學(xué)來(lái)研究探討更明晰的結(jié)論。

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