寸怡娜，蔡瑋，宋紹輝，周健，歐陽圣潔，胡文著，李衛(wèi)東，廖國(guó)陽，馬磊

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，昆明　650118)

脊髓灰質(zhì)炎(以下簡(jiǎn)稱“脊灰”)是由脊髓灰質(zhì)炎病毒I、II、III型引起的傳播廣泛且危害極大的急性傳染病[1]。接種脊灰疫苗是控制與消滅脊灰最重要且有效的手段，國(guó)內(nèi)外應(yīng)用的脊灰疫苗有兩種：口服脊灰減毒活疫苗(oral poliovirus vaccine，OPV)和脊灰滅活疫苗(inactivated poliovirus vaccine，IPV)。目前，全球合作消滅脊灰取得了重要進(jìn)展，野毒株(WPV)僅在巴基斯坦、阿富汗兩個(gè)國(guó)家流行。全球消滅脊灰后，由于口服OPV可引起疫苗相關(guān)病例(vaccine-associated paralytic poliomyelitis, VAPP)和疫苗衍生株病毒(vaccine-derived poliovirus, VDPV)，將被停止使用，在消滅脊灰的最后階段，只有使用IPV代替OPV才能最終根除脊髓灰質(zhì)炎[2-3]。

減毒株(Sabin株)生產(chǎn)的IPV(sIPV)，因其生物安全性高，適合在全球尤其第三世界國(guó)家推廣使用[4-7]。2015年1月，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所研制的sIPV三價(jià)疫苗獲準(zhǔn)上市，該疫苗對(duì)于保障中國(guó)及全球?qū)崿F(xiàn)消滅脊灰的目標(biāo)具有重要的戰(zhàn)略意義。動(dòng)物體內(nèi)效力試驗(yàn)，是疫苗有效性的重要質(zhì)量控制指標(biāo)[8]。傳統(tǒng)的IPV疫苗的肌肉注射途徑效力評(píng)價(jià)是采用Wistar大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，而云南本地的版納小耳豬屬華南型豬種，體型小發(fā)育慢，6月齡體高40 cm左右，體長(zhǎng)在60～75 cm，體重20～30 kg，體重相當(dāng)同齡大型豬的1/4～1/5，平均日增重120～150 g，其皮膚厚度和結(jié)構(gòu)與人類更接近[9]。本研究采用版納小耳豬新動(dòng)物模型進(jìn)行sIPV疫苗免疫安全性和有效性的評(píng)價(jià)，為今后新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物版納小耳豬在脊灰疫苗評(píng)價(jià)中的應(yīng)用積累科學(xué)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

版納小耳豬，等級(jí)：普通級(jí)，25只，雌13只，雄12只，3～4月齡，體重6～10 kg，由西雙版納小型豬飼養(yǎng)基地提供，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)【SYXK(滇)K2013-0008】。

1.1.2實(shí)驗(yàn)疫苗及參考品

sIPV疫苗由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所制備，每瓶0.5 mL，抗原含量為I、II、III型30、32、45 DU。2～8℃保存，嚴(yán)禁凍結(jié)。wIPV疫苗由賽諾菲巴斯德制備，每瓶0.5 mL，抗原含量為I、II、III型40、8、32 DU。2～8℃保存，嚴(yán)禁凍結(jié)。

D抗原檢測(cè)多克隆抗體(?？?、兔抗)：捕獲抗體(一抗)，各型經(jīng)純化獲得的?？筍abin-Polio IgG；檢測(cè)抗體(二抗)，各型經(jīng)純化獲得的兔抗Sabin-Polio IgG均由本所提供。

1.2　方法

1.2.1動(dòng)物分組及免疫

版納小耳豬25只，其中sIPV實(shí)驗(yàn)組和wIPV對(duì)照組各10只， 生理鹽水陰性對(duì)照組5只。肌肉注射每只版納小耳豬0.5 mL。間隔1個(gè)月，共進(jìn)行3次免疫。每次免疫前尾靜脈采血2～3 mL，分離血清，置-60℃保存。

1.2.2血清脊灰中和抗體檢測(cè)

采用微量中和實(shí)驗(yàn)法[10]。能夠保護(hù)50%細(xì)胞不受100 CCID50攻擊病毒液感染的血清最高稀釋度就是該血清的抗體滴度。中和抗體滴度< 1∶8記為陰性“—”。

陽轉(zhuǎn)率的判定方法為：免前抗體滴度< 1∶8，免后≥1∶8判為陽轉(zhuǎn)。

1.2.3安全性評(píng)價(jià)

安全性觀察實(shí)驗(yàn) 在疫苗免疫后連續(xù)7 d觀察接種部位是否引起紅斑或水腫等局部反應(yīng)。動(dòng)物分組前、給藥后1周內(nèi)每天進(jìn)行稱重，比較與對(duì)照組的差異。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用Office Excel 和SPSS 21. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用χ2檢驗(yàn)和方差分析，以P< 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　免疫原性結(jié)果

2.1.1血清學(xué)中和抗體陽轉(zhuǎn)率結(jié)果

I型脊灰病毒中和抗體陽轉(zhuǎn)率：第1劑免疫后，sIPV組陽轉(zhuǎn)率達(dá)到80%，wIPV組的陽轉(zhuǎn)率為60%，兩組間差異無顯著性(P=0.626)。第2劑免疫后，sIPV組達(dá)到了100%，wIPV組的陽轉(zhuǎn)率為90%，組間差異無顯著性(P=1.000)。第3劑免疫后，兩組陽轉(zhuǎn)率均達(dá)到了100%。II型脊灰病毒中和抗體陽轉(zhuǎn)率：第1劑免疫后，sIPV組陽轉(zhuǎn)率為80%，與wIPV組一致。第2劑免疫后，sIPV組陽轉(zhuǎn)率為90%，wIPV組陽轉(zhuǎn)率也為90%。第3劑免疫后，兩組均達(dá)到了100%。III型脊灰病毒中和抗體陽轉(zhuǎn)率：第1劑免疫后，sIPV組陽轉(zhuǎn)率為40%，wIPV組為30%，組間差異無顯著性(P=1.000)。第2劑免疫后，sIPV組和wIPV組陽轉(zhuǎn)率均為80%。第3劑免疫后，兩組均達(dá)到了100%。詳細(xì)結(jié)果見表1。

2.1.2血清學(xué)中和抗體幾何平均滴度(GMT)結(jié)果

I、II、III型脊灰病毒中和抗體GMT，除I型病毒第2劑免疫后30 d和第3劑免疫后30天sIPV組GMT顯著高于wIPV組外，其余均差異無顯著性，3劑免疫后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組GMT均遠(yuǎn)高于1∶8，結(jié)果詳見表2。

表1　免疫接種30 d后版納小耳豬后抗脊灰病毒I、II、III型中和抗體陽轉(zhuǎn)率(n=10，%)Tab.1　Seroconversion rate of the anti-polio type I, II and III antibodies after each dose immunization in the mini pigs (n=10，%)

表2　免疫接種30 d后版納小耳豬后抗脊灰病毒I、II、III型中和抗體GMT(n=10，1∶x)Tab.2　Geometric mean titers (GMT) of the anti-polio type I, II and III antibodies after each dose immunization in the mini pigs (n=10，1∶x)

2.2　免疫后安全性觀察

每針免疫后對(duì)各組小耳豬進(jìn)行持續(xù)觀察，發(fā)現(xiàn)版納小耳豬毛色光滑，食欲、精神狀況和活動(dòng)情況均正常，未出現(xiàn)體重下降、掉毛等現(xiàn)象。免疫后7 d 每天進(jìn)行觀察及稱重，發(fā)現(xiàn)每組小耳豬體重穩(wěn)定的增長(zhǎng)，并且各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間體重差異無顯著性(見圖1)。肌肉注射觀察腿部肌肉注射局部，也未見紅腫、硬結(jié)等現(xiàn)象。

圖1　版納小耳豬免后體重變化結(jié)果Fig.1　Body weight changes of the pigs after immunization

3　討論

早在20世紀(jì)80年代醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所就開始研制sIPV，并確立了采用Vero 細(xì)胞微載體大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)sIPV的生產(chǎn)工藝[11]，Ⅲ期臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，sIPV具有良好的安全性和免疫原性，肌肉注射劑型的sIPV已經(jīng)于2015年6月成功獲批上市[12]。傳統(tǒng)的IPV疫苗的肌肉注射途徑效力評(píng)價(jià)是用Wistar大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，本研究選用云南本地的版納小耳豬作為評(píng)價(jià)IPV安全性及有效性的新的動(dòng)物模型，通過對(duì)比豬與人的皮膚厚度及結(jié)構(gòu)的研究認(rèn)為豬的皮膚構(gòu)造和人的較為相似，并且豬在解剖、代謝等遺傳特征上與人相似[13-14]，因此本研究的目的在于評(píng)價(jià)IPV疫苗在版納小耳豬體內(nèi)的免疫原性及安全性，為新型動(dòng)物模型提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

從版納小耳豬的3劑基礎(chǔ)免疫免疫原性結(jié)果來看，第1劑免疫完成后，sIPV組和wIPV組陽轉(zhuǎn)率各型別組間差異無顯著性，且兩組均顯著性的高于生理鹽水對(duì)照組，GMT水平較低，僅sIPV組Ⅰ型和wIPV組Ⅱ型GMT水平高于1∶8。第2劑免疫后，sIPV組和wIPV組各型別陽轉(zhuǎn)率均達(dá)到80%以上，且組間差異無顯著性，GMT水平增長(zhǎng)顯著，各型別滴度均高于1∶8。第3劑免疫后，sIPV組和wIPV組陽轉(zhuǎn)率各型別均達(dá)到了100%，I、II、III三個(gè)型別，sIPV組GMT水平分別為：257.07、113.93、206.50，wIPV組GMT水平分別為：161.12、156.50、190.55，GMT水平均遠(yuǎn)高于1∶8。結(jié)果表明，3劑基礎(chǔ)免疫后，sIPV和wIPV疫苗免疫版納小耳豬能夠產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)水平和較高的GMT水平。

安全性是評(píng)價(jià)新型動(dòng)物模型的重要方面，在本研究中，我們從版納小耳豬接種部位觀察及體重觀察評(píng)價(jià)了sIPV及wIPV疫苗的安全性，不管從版納小耳豬的狀態(tài)、體重還是注射部位情況觀察，證明了sIPV及wIPV疫苗接種版納小耳豬是安全的。

綜上所述，IPV相關(guān)版納小耳豬新型動(dòng)物模型的研究國(guó)內(nèi)外還未見報(bào)道。本研究通過評(píng)價(jià)sIPV及wIPV疫苗在版納小耳豬體內(nèi)的安全性及免疫原性，證明了版納小耳豬能夠作為評(píng)價(jià)IPV疫苗的新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。此新型動(dòng)物模型對(duì)今后脊灰疫苗的研究及應(yīng)用將具有非常重要的意義。