王書超　張宇　何爽

【摘 要】 本研究以樹舌靈芝為試材，利用單因素試驗(yàn)分析碳源、氮源、溫度及pH等因素對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，進(jìn)一步采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)對樹舌靈芝發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明在含20g/L玉米粉，5g/L豆粕的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基（pH5.5）中，28℃條件下振蕩培養(yǎng)7d，漆酶活性最高。

【關(guān)鍵詞】 樹舌靈芝；漆酶；發(fā)酵條件；優(yōu)化

漆酶（Laccase）在環(huán)境治理、制漿造紙、生物監(jiān)測、食品監(jiān)測和綠色有機(jī)合成等領(lǐng)域也發(fā)揮著重要作用[1-2]。雖然漆酶在自然界中分布廣泛，但真正具有較高漆酶產(chǎn)量的菌株并不多見[3]，且漆酶的發(fā)酵生產(chǎn)，國內(nèi)目前尚未出現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)的酶量還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足工業(yè)應(yīng)用的需要，而主要依靠于進(jìn)口，價(jià)格比較昂貴。因此，漆酶穩(wěn)定高產(chǎn)菌株的選育十分必要[4]，同時對產(chǎn)酶條件的優(yōu)化以及產(chǎn)酶調(diào)控機(jī)理的研究對于最終其規(guī)?；a(chǎn)意義重大。本研究在前期實(shí)驗(yàn)確定樹舌靈芝產(chǎn)漆酶的基礎(chǔ)上，對該菌株發(fā)酵產(chǎn)漆酶培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，提高產(chǎn)酶效率，以便為產(chǎn)漆酶菌種的發(fā)酵生產(chǎn)及漆酶的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

菌種樹舌靈芝（Ganoderma applanatum），由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物工程學(xué)院分離并保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

①PDA 培養(yǎng)基 ②發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：馬鈴薯200g/L 、葡萄糖20g/L 、酵母膏5.0g/L、KH2PO4 3.0g/L 、MgSO4 1.5g/L 、ZnSO4 0.05g/L 、MnSO4 0 .05g/L。

1.2 試驗(yàn)方法

無菌條件下，將樹舌靈芝菌株接種到PDA 培養(yǎng)基上，25 ℃避光培養(yǎng) 8 d。取活化好的菌絲塊接種于100mL 液體發(fā)酵培養(yǎng)基中， 150 r/min 避光培養(yǎng)。抽濾分離發(fā)酵液，取濾液測定OD420nm吸光值。

分別以不同碳源（葡萄糖，蔗糖，淀粉，玉米粉，小麥麩皮）、氮源（蛋白胨，尿素，硫酸銨，硝酸銨，豆粕）代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖和硫酸銨進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)[6-7]，以ΔOD值為指標(biāo)，分析不同碳源及氮源對樹舌靈芝發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響；進(jìn)一步考察不同溫度（24℃，26℃，28℃，30℃，32℃）及pH（4.5，5.0，5.5，6.0，6.5）對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)對樹舌靈芝發(fā)酵產(chǎn)漆酶條件進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同碳源對樹舌漆酶活性的影響

如圖1所示，在淀粉，玉米粉，葡萄糖以及蔗糖4種碳源中，玉米粉為最適合的碳源，其次分別為小麥麩皮、淀粉。

2.1.4 不同pH對樹舌漆酶活性的影響

由圖4所示，當(dāng)pH5.0 時漆酶活性的最大，隨著pH的升高，樹舌漆酶活性逐漸降低。但當(dāng)pH為6.5時，漆酶的活性又大幅回升。對于pH的影響不能簡單認(rèn)為是直接影響漆酶活性，也可能是因?yàn)楦淖兞伺囵B(yǎng)環(huán)境導(dǎo)致其他成分發(fā)生改變間接導(dǎo)致漆酶活性的變動。

由表2可知，最佳組合為A1B2C2D2，即培養(yǎng)基中碳源為玉米粉，氮源為豆粕，pH為5.5，發(fā)酵溫度為28℃時酶活性最高。極差分析表明，對樹舌產(chǎn)酶的影響，碳源>氮源>溫度>pH。

3 結(jié)論

在前期平板實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證樹舌靈芝產(chǎn)漆酶活性較高的基礎(chǔ)上，通過單因素實(shí)驗(yàn)與正交試驗(yàn)對樹舌靈芝產(chǎn)漆酶培養(yǎng)條件進(jìn)行了分析并優(yōu)化，最終確定了適合樹舌靈芝液體發(fā)酵產(chǎn)漆酶的最佳工藝條件。最適產(chǎn)酶培養(yǎng)基為馬鈴薯200g/L 、玉米粉20g/L 、豆粕5.0g/L、KH2PO4 3.0g/L 、MgSO4 1.5g/L 、ZnSO4 0.05g/L 、MnSO4 0 .05g/L（pH5.5），28℃條件下發(fā)酵7d漆酶活性最高。雖然本研究初步確定了樹舌靈芝漆酶的發(fā)酵條件，但對于其應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)還有一段距離，目前研究小組正在對樹舌靈芝進(jìn)行誘變育種及下游漆酶的分離純化工藝的研究，以期望不久的將來能將研究結(jié)果推廣到大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中，對未來漆酶的應(yīng)用提供一定的參考。

參考文獻(xiàn)：

[1] 姜竹茂， 纓靜.漆酶的最新研究進(jìn)展[J]. 煙臺師范學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2001： 123-28.

[2] 劉蘋， 唐志紅， 李夢玉， 等. 金針菇漆酶活性測定的最佳反應(yīng)條件及液體培養(yǎng)胞外酶的研究[J].食品科技， 2012，（ 6） ： 14-17.

[3] 凡軍民， 高大響， 劉進(jìn)華， 等. 樹舌靈芝深層發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化研究[J].食品與機(jī)械，2010.

[4] 潘志恒，岳鹍，孫勇民，等.樹舌靈芝發(fā)酵產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基優(yōu)化[J] .保鮮與加工， 2016，16（4）：107-111.