馮曉曉，李海嬌，李 玲，王教瑜*，林福呈，盧建平，*

(1.水稻生物學(xué)國家重點實驗室，浙江大學(xué) 生物技術(shù)研究所，浙江 杭州310058；2.浙江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州310058；3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護與微生物研究所，浙江 杭州310021；4.浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311300)

GCK家族蛋白激酶MoSOK1調(diào)控稻瘟病菌的生長發(fā)育與致病性

馮曉曉1，李海嬌2，李 玲3，4，王教瑜3，*，林福呈1，盧建平2，*

(1.水稻生物學(xué)國家重點實驗室，浙江大學(xué) 生物技術(shù)研究所，浙江 杭州310058；2.浙江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州310058；3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護與微生物研究所，浙江 杭州310021；4.浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311300)

摘 要：稻瘟病菌致病相關(guān)基因功能的研究有助于揭示其致病機理，為稻瘟病防治提供理論依據(jù)。本研究利用基因替換技術(shù)對稻瘟病菌SOK1同源基因(MoSOK1)進行了分析。MoSOK1編碼GCK(germinal center kinase)家族的Ste20蛋白激酶，其與全蝕病菌中對應(yīng)蛋白具有最高同源性。本研究表明，MoSOK1基因在附著胞分化關(guān)鍵期上調(diào)表達；與野生型菌株相比，MoSOK1基因缺失突變體菌落顏色加深，氣生菌絲減少，生長速度變慢，產(chǎn)孢量下降，分生孢子萌發(fā)延遲，致病性降低。另外，交配實驗表明，MoSOK1基因缺失突變體能夠進行交配，但產(chǎn)子囊殼能力降低。本研究初步表明，MoSOK1基因參與稻瘟病菌生長發(fā)育和致病過程。

關(guān)鍵詞：稻瘟病菌；致病相關(guān)基因；MoSOK1

稻瘟病是水稻上危害最嚴重的病害，給全世界水稻生產(chǎn)帶來巨大威脅。稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)是一種絲狀子囊真菌，具有典型的生活史和侵染循環(huán)[1]。2002年10月稻瘟病菌70-15菌株全基因組序列草圖繪制完成[2]。稻瘟病菌成為絲狀真菌致病機理和分子生物學(xué)研究的理想模式之一。稻瘟病菌致病分子機制的研究，不僅為稻瘟病的防治提供理論依據(jù)，而且對了解其他病原真菌的致病機理及與寄主互作具有重要參考價值。利用同源重組對致病相關(guān)基因進行敲除，通過分析突變體的表型明確基因功能，是目前稻瘟病菌致病機制研究中最行之有效的技術(shù)手段[3-5]。

稻瘟病菌分生孢子接觸到寄主葉片后，在溫濕度適宜條件下萌發(fā)形成芽管[6]，4h內(nèi)，芽管頂端膨大形成附著胞(appressorium)[7-8]。稻瘟病菌附著胞細胞壁上沉積大量黑色素，內(nèi)部積累高濃度甘油，從而形成強大的滲透壓以穿透寄主表皮[7，9-10]。附著胞形成和分化是稻瘟病菌致病機理研究的一個熱點。附著胞分化受多種理化因子的誘導(dǎo)[11-12]，包括基物硬度[13]和疏水性[11]等。參與稻瘟病菌附著胞分化形成的主要信號傳導(dǎo)途徑已經(jīng)相當(dāng)明確，包括G蛋白途徑[14-15]、MAPK途徑[6，16-17]、cAMP途徑[18]和RAS途徑[19]等。RAS-cAMP途徑通過調(diào)控cAMP依賴性蛋白激酶(PKA)起作用，從而參與眾多的生物學(xué)過程，是環(huán)境脅迫條件下細胞生長的主要調(diào)控因子[20]。稻瘟病菌的CPKA基因缺失后，附著胞分化滯后、功能異常、無法穿透表皮，嚴重影響致病性。同時，生長、產(chǎn)孢和有性生殖均受到影響[21-22]。

SOK1基因編碼一種GCK(germinal center kinase)家族的蛋白激酶。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中，SOK1基因的過表達能夠抑制PKA(cyclic-AMP dependent protein kinase A)突變體的生長缺陷[23-24]。在哺乳動物中，SOK1基因可以被活性氧(reactive oxygen species，ROS)激活，誘導(dǎo)依賴半胱天冬酶的細胞凋亡過程[25-26]。而活性氧的產(chǎn)生和降解以及細胞凋亡對于病原真菌的致病性也都是至關(guān)重要的影響因子[27-31]。目前，SOK1基因是否可以影響植物病原真菌的生長發(fā)育和致病性，尚無報道。本研究利用基因敲除對稻瘟病菌SOK1基因(MoSOK1)的功能進行了分析，初步揭示了SOK1在稻瘟病菌生長發(fā)育和致病過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)條件

稻瘟病菌野生型菌株Guy11與2539，為研究常用菌株，本實驗室保存。MoSOK1基因敲除突變體菌株在本研究中獲得。野生型菌株、各轉(zhuǎn)化子與突變菌株，均在完全培養(yǎng)基(complete medium，CM)上28℃培養(yǎng)[32]。在液體CM中培養(yǎng)3d的菌絲體用于提取基因組DNA。轉(zhuǎn)化子篩選采用含有100μg·mL-1氯嘧磺隆(Sigma，USA)的DCM培養(yǎng)基[33]。

1.2 生物信息學(xué)分析

以釀酒酵母SOK1基因的蛋白序列(YDR006C)為檢索對象在稻瘟病菌基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.broad.mit.edu/annotation/fungi/magnaporthe/index.html/)中進行檢索。序列比對使用在線程序mafft(http://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py#forms::mafft)，參數(shù) Gap opening penalty 設(shè)置為2.0，offset value 設(shè)置為0.1。序列連配結(jié)果導(dǎo)入GeneDoc 2.0 進行校準(zhǔn)，導(dǎo)入MEGA 5.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 MoSOK1基因敲除突變體的獲得

以野生型Guy11基因組為模板，利用引物SOK1-up-p1和SOK1-up-p2擴增873bp的MoSOK1上游片段，以BamHⅠ-EcoRⅤ酶切連接入pBS-SUR[33]得到pBS-SOK1up；利用引物SOK1-dn-p1和SOK1-dn-p2擴增962bp的下游片段，EcoRⅠ-XbaⅠ酶切連接入pBS-SOK1up，獲得基因置換載體pBS-SOK1。

利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將pBS-SOK1導(dǎo)入野生菌株Guy11，利用氯嘧磺隆抗性篩選轉(zhuǎn)化子。利用引物SOK1yz1和SOK1yz2對轉(zhuǎn)化子進行PCR初篩，并進一步通過Southern雜交和定量PCR對可能的突變體進行驗證。本研究所用引物詳見表1。

1.4 致病性測定

采用生長14d的水稻CO39 與8d的大麥ZJ-8，參照Liu等[3]的方法，分別測定野生型、突變體對水稻和大麥葉片的致病力，5d后觀察記錄發(fā)病情況。實驗重復(fù)3次。

1.5 菌落生長、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率與附著胞形成率的測定

將野生型及突變體菌株以0.5cm菌餅接種于CM平板上，25℃，12h/12h光暗交替培養(yǎng)，每處理3個重復(fù)，生長10d后觀察菌落形態(tài)，測量菌落直徑。取CM上生長10d的菌落，加入3mL無菌水，用玻棒輕輕刮取孢子，經(jīng)3層擦鏡紙過濾后用血球計數(shù)板測定分生孢子濃度，計算產(chǎn)孢量。用無菌水將分生孢子懸浮液濃度調(diào)節(jié)至1×105mL-1，滴于塑料蓋玻片上，每滴200μL，25℃黑暗保濕培養(yǎng)，2、4和6h后分別取樣，鏡檢孢子萌發(fā)和附著胞形成情況，計算萌發(fā)率和附著胞形成率。

1.6 菌株有性雜交

分別取0.5cm的菌株2539與Guy11(或MoSOK1突變菌株)菌餅，呈十字交叉接種于OMA平板上。20℃，24h連續(xù)光照培養(yǎng)30d，觀察子囊殼、子囊及子囊孢子的形成情況。實驗重復(fù)3次。

1.7 核酸操作及Southern雜交

基因組DNA提取采用CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)法[32]。PCR、電泳、酶切、連接、Southern雜交等采用標(biāo)準(zhǔn)程序。真菌總RNA提取使用Trizol試劑(Invitrogen，USA)，cDNA合成使用AMV反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa Bio，Japan)?；蜣D(zhuǎn)錄水平定量檢測采用7500 實時定量PCR 系統(tǒng)(Applied Biosystems，F(xiàn)oster，USA)，以β-Tubulin(MGG_00604)為內(nèi)參基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 MoSOK1基因的鑒定

以釀酒酵母SOK1基因的蛋白序列(YDR006C)在稻瘟病菌基因組數(shù)據(jù)庫進行同源檢索，發(fā)現(xiàn)假想基因MGG_12111與酵母SOK1最為相似(氨基酸相似度為31%)，本研究定名為MoSOK1。根據(jù)基因組信息設(shè)計引物SOK1-CDS-p1與SOK1-CDS-p2，以菌絲孢子混合RNA合成的cDNA為模板，擴增MoSOK1編碼區(qū)并進行序列測定。結(jié)果表明，MoSOK1開放閱讀框由4個外顯子，3個內(nèi)含子組成，編碼區(qū)總長度3 191bp，編碼一個728氨基酸殘基的多肽。不同物種SOK1的序列對比顯示MoSOK1與全蝕病菌(Gaeumannomycesgraminis)SOK1同源基因序列最為接近(氨基酸一致性為62%)(圖1-A)。

為了明確MoSOK1基因在稻瘟病菌中的表達動態(tài)，我們利用定量PCR檢測基因在孢子萌發(fā)和附著胞形成過程中的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MoSOK1在孢子萌發(fā)過程中逐漸上調(diào)表達，誘導(dǎo)12h后達到峰值，然后逐漸下降(圖2)。孢子萌發(fā)10～12h是附著胞分化的關(guān)鍵時期，MoSOK1的表達模式提示該基因可能在孢子萌發(fā)和附著胞分化過程中發(fā)揮作用。

2.2 MoSOK1基因敲除突變體的獲得

表1本研究所用引物列表

Table1Primers used in this study

名稱Name序列Sequence作用FunctionSOK1-up-p15'-AggatccTGCCTGGGCTGCTGGTTAC-3'擴增敲除載體上臂Amplification of flank region upstream of MoSOK1SOK1-up-p25'-AgatatcGATGAAGAGATGGCGGCGAT-GAA-3'SOK1-dn-p15'-AgaattCTCGGCGGGATTCACTTAT-GTTTC-3'擴增敲除載體下臂Amplification of flank region downstream of MoSOK1SOK1-dn-p25'-AtctagaTCGCCCTGCAGTGACCTTTGT-GA-3'SOK1yz15'-GACTTTGTCTTTGAAGCACCTA-3'敲除突變體篩選Mutant selection and confirmationSOK1yz25'-TCTGCGTCGGATTTGGTA-3'SOK1-CDS-p15'-TAggatccATGACTGAGCAAGGGGCTG-3'擴增基因編碼區(qū)Amplification of CDS of MoSOK1SOK1-CDS-p25'-TAggatccAGCGTCAGACATCTCCAT-3'SOK1qRTp15'-CAATATGAGGATCTGGAGCAGG-3'定量PCR檢測Quantitative reverse-transcriptional PCRSOK1qRTp25'-CAGGGTTGAATAAAGCTTCGC-3'TubulinqRTp15'-ATTGTTCACCTTCAGACCGG-3'定量PCR內(nèi)參Reference gene for qRT-PCRTubulinqRTp25'-TTGAAGTAGACGCTCATACGC-3'

A，稻瘟病菌MoSOK1(MGG_12111)與釀酒酵母SOK1(YDR006C)及柄孢霉Podospora anserina(CDP30447.1)、粗糙脈孢菌Neurospora crassa(CAD21116.1)、蘋果黑腐皮殼菌Valsa mali(KUI52511.1)、全蝕病菌Gaeumannomyces graminis(EJT79517.1)、稻曲病菌Ustilaginoidea virens(KDB18427.1)、大麗輪枝菌Verticillium dahlia(EGY15838.1)、膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides(EQB58259.1)中同源基因的蛋白序列聯(lián)配，氨基酸背景顏色越深表示保守性越高；B，根據(jù)序列聯(lián)配結(jié)果，使用MEGA5.0 程序構(gòu)建的SOK1基因的系統(tǒng)進化樹。A，Amino acid sequences of MoSOK1(MGG_12111)，Saccharomyces cerevisiae SOK1(YDR006C) and the homologues from Podospora anserina(CDP30447.1)，Neurospora crassa(CAD21116.1)，Valsa mali(KUI52511.1)，Gaeumannomyces graminis(EJT79517.1)，Ustilaginoidea virens(KDB18427.1)，Verticillium dahlia(EGY15838.1) and Colletotrichum gloeosporioides(EQB58259.1) were aligned with ClustalW.The identical amino acids are highlighted against a black background，the conserved residues on a dark gray background，and the similar residues on a light gray background.B，Phylogenetic relationship of SOK1 homologs calculated with neighbor-joining method using the MEGA 5.0 program according to the alignment.圖1 MoSOK1同源基因序列比對與系統(tǒng)發(fā)育進化分析Fig.1 Multiple sequences alignment and phylogeny evolution analysis of SOK1 homologs

圖2 MoSOK1基因在孢子萌發(fā)過程中的相對表達量Fig.2 Relative expression level of MoSOK1 during conidial germination

為了明確MoSOK1的功能，我們進行了基因敲除。分別擴增MoSOK1的上下游序列，插入到含有篩選標(biāo)記基因SUR的載體pBS-SUR[33]中，獲得敲除載體pBS-SOK1。利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化導(dǎo)入稻瘟病菌野生型菌株，通過抗性篩選共獲得36個氯嘧磺隆抗性轉(zhuǎn)化子。利用引物SOK1yz1和SOK1yz2進行PCR初篩，進一步利用Southern雜交和定量PCR進行驗證，表明菌株sok1-27，sok1-29為MoSOK1基因敲除突變體(圖3)。

2.3 MoSOK1參與稻瘟病菌營養(yǎng)生長與產(chǎn)孢

在CM上生長10d，野生型菌株Guy11菌落呈灰褐色，氣生菌絲濃密，菌落邊緣絨毛狀，而Δmosok1突變體sok1-27、sok1-29菌落氣生菌絲明顯減少，顏色加深，菌落邊緣光滑(圖4-A)。同時，Δmosok1比野生型Guy11的菌落直徑小，表明在CM上Δmosok1的生長速度較野生型Guy11慢(圖4-B)。

統(tǒng)計CM上生長10d菌落的產(chǎn)孢量，發(fā)現(xiàn)Guy11菌株單位面積產(chǎn)孢量為(2.03±0.58)×104mm-2，而Δmosok1突變體sok1-27、sok1-29菌株單位面積產(chǎn)孢量分別為(1.21±0.32)×104mm-2和(1.09±0.28)×104mm-2，約為Guy11的1/2(圖4-C)，但Δmosok1的孢子形態(tài)無明顯改變。上述結(jié)果表明，MoSOK1基因影響稻瘟病菌的營養(yǎng)生長與產(chǎn)孢。

2.4 MoSOK1基因缺失導(dǎo)致分生孢子萌發(fā)延遲

A，MoSOK1基因替換示意圖，突變體中，MoSOK1被篩選標(biāo)記基因SUR所取代。B，轉(zhuǎn)化子的PCR篩選(部分)，無擴增條帶者為可能突變體。1，sok1-27；3，sok1-29；2，4-7，隨機插入轉(zhuǎn)化子。C，可能突變體(sok1-27、sok1-29)的Southern 雜交驗證。D，突變體(sok1-27)的反轉(zhuǎn)錄PCR 驗證，突變體中完全檢測MoSOK1的轉(zhuǎn)錄本。A，Schematic map for targeted gene replacement of MoSOK1.B，Screening for potential knockout mutants.Lane 1，sok1-27(Δmosok1);Lane 3，sok1-29(Δmosok1);Lane 2，and 4 to 7，ectopic transformants.C，Δmosok1 mutants(sok1-27 and sok1-29) via Southern blotting.D，Check of the Δmosok1 mutant sok1-27 via RT-PCR.圖3 MoSOK1基因敲除突變體的獲得Fig.3 Generation of Δmosok1 mutants

野生型Guy11和突變體Δmosok1的分生孢子懸浮液在塑料蓋玻片表面上誘導(dǎo)孢子萌發(fā)和附著胞形成，在2h時，野生型Guy11的平均萌發(fā)率為84.20%，而Δmosok1菌株的萌發(fā)率顯著低于前者；4h時，Δmosok1菌株的孢子萌發(fā)率有較大增加，但仍然低于同等條件下野生型Guy11的萌發(fā)率；而Δmosok1的附著胞形成率與野生型Guy11相比差異不顯著(表2)。結(jié)果表明，MoSOK1基因的缺失導(dǎo)致分生孢子萌發(fā)延遲，但不影響到附著胞的形成。

2.5 Δmosok1突變體致病性分析

A，稻瘟病菌在完全培養(yǎng)基(CM)生長10d的菌落情況；B，菌落直徑統(tǒng)計；C，產(chǎn)孢量統(tǒng)計。A，The wild type Guy11 and Δmosok1 were cultured on complete medium for 10d;B，The diameters of the colonies were statistically compared;C，Conidiation in Δmosok1 mutants.圖4 Δmosok1突變體的營養(yǎng)生長及產(chǎn)孢情況Fig.4 Vegetative growth and sporulation of mutant Δmosok1

表2 Δmosok1的孢子萌發(fā)率和附著胞形成率

同一列數(shù)據(jù)后沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

The values in the same column without the same letters showed the significance(P<0.05).

為了明確MoSOK1在稻瘟病菌致病過程中的作用，我們將稻瘟病菌分生孢子接種于14d的水稻幼苗和8d的大麥離體葉片上進行致病性分析。結(jié)果顯示，與野生型相比，Δmosok1突變體(sok1-27)致病性降低。Δmosok1突變體可在水稻上產(chǎn)生點狀病斑，但病斑不能正常擴展。大麥葉片點接種呈現(xiàn)同樣的結(jié)果，突變體病斑明顯弱于野生型(圖5)。表明MoSOK1基因參與稻瘟病菌的致病過程。

圖5 Guy11和Δmosok1突變體在水稻(A)和大麥(B)葉片上的致病性Fig.5 Pathogenicity test of wild type Guy11 and Δmosok1 mutant on rice(A) and barley(B) leaves

2.6 MoSOK1參與稻瘟病菌的有性世代產(chǎn)生

為了探究MoSOK1基因是否在稻瘟病菌有性世代形成過程中起作用，我們進行了交配實驗分析。我們將2539菌株(交配型MAT1-1)分別同Guy11和Δmosok1突變體sok1-27交叉接種于OMA進行交配試驗。在20℃恒溫持續(xù)光照下，OMA培養(yǎng)基上培養(yǎng)28d，野生型Guy11與2539的交界處形成大量子囊殼，而Δmosok1突變體sok1-27與2539形成的子囊殼明顯偏少(圖6)。結(jié)果表明，MoSOK1基因影響了稻瘟病菌有性世代的形成。

交界處黑色斑點為子囊殼。The black spot at the junction is the perithecium.圖6 Δmosok1與2539的有性雜交Fig.6 Mating test of strain 2539 with Guy11 or Δmosok1(sok1-27) mutant

3 小結(jié)與討論

作為絲狀真菌致病機理和分子生物學(xué)研究的模式生物，稻瘟病菌致病相關(guān)功能基因的分析對于稻瘟病防治和探究絲狀真菌生長發(fā)育和致病機制具有重要的科學(xué)意義[1]。通過反向遺傳學(xué)方法，分析相關(guān)代謝途徑，根據(jù)酵母、哺乳動物中的基因進行推測，從而克隆和分析可能影響致病性的同源基因，是稻瘟病菌功能基因分析的重要方法之一，利用此方法克隆和分析的功能基因有近百個[3-4，34]。本研究中我們對稻瘟病菌SOK1同源基因進行了分析，結(jié)果表明，該基因參與稻瘟病菌致病相關(guān)的多個過程，為進一步分析下游途徑奠定了基礎(chǔ)。

釀酒酵母中，SOK1基因的過表達能夠抑制PKA突變體的生長缺陷[23-24]。PKA參與眾多的生物學(xué)過程，包括環(huán)境脅迫條件下的細胞生長[19]，但酵母SOK1基因缺失并不影響其生長。本研究表明，稻瘟病菌MoSOK1基因缺失造成多重影響，包括氣生菌絲生長減弱、孢子萌發(fā)減慢和致病性降低，彌補了酵母中突變體表型不明顯的缺陷，為SOK1基因功能的進一步揭示提供了可能。另外，也表明SOK1基因在不同生物體中參與的代謝過程并不完全相同，稻瘟病菌SOK1的調(diào)控機制比酵母更加復(fù)雜。

哺乳動物中，SOK1可被活性氧(reactive oxygen species，ROS)激活從而誘導(dǎo)細胞凋亡[25-26]。在植物與病原菌互作過程中，植物細胞產(chǎn)生大量ROS，誘發(fā)抗病反應(yīng)，包括細胞凋亡，從而限制病原菌擴展[27]，病原菌必須克服ROS才能成功寄生。稻瘟病菌谷胱甘肽過氧化物酶基因MoHYR1突變體對H2O2耐受性下降，同時對大麥和水稻葉片的致病力減弱[30]。稻瘟病菌過氧化氫酶基因CATB缺失導(dǎo)致稻瘟病菌菌絲、孢子和附著胞形態(tài)的改變，進而影響其致病力[29]，表明了ROS在病菌侵染過程中的重要作用。本研究表明，MoSOK1突變體在葉片上形成病斑的擴展速度明顯低于野生型，但病斑的數(shù)量較野生型并無明顯變化。同時，突變體附著胞的形成率和侵染率并無明顯變化。因此，突變體致病性的下降應(yīng)該是由于孢子萌發(fā)速率降低和侵入后的侵染菌絲擴展減緩造成的。寄主活性氧對病菌的影響主要體現(xiàn)在對病菌侵入后的生長抑制作用[30]。因此，MoSOK1可能與病菌抵抗ROS有關(guān)聯(lián)。另外，MoSOK1還影響分生孢子和有性世代的產(chǎn)生，表明了該基因功能的多樣性，這與ROS能參與生物體的多種發(fā)育調(diào)控也是一致的[27]。MoSOK1如何受ROS激活從而調(diào)控病菌生長發(fā)育和發(fā)病過程，有待進一步研究。

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[1] EBBOLE D J.Magnaportheas a model for understanding host-pathogen interactions[J].AnnualReviewofPhytopathology，2007，45:437-456.

[2] DEAN R A，TALBOT N J，EBBOLE D J，et al.The genome sequence of the rice blast fungusMagnaporthegrisea[J].Nature，2005，434(7036):980-986.

[3] LIU X H，LU J P，ZHANG L，et al.Involvement of aMagnaporthegriseaserine/threonine kinase gene，MgATG1，in appressorium turgor and pathogenesis[J].EukaryoticCell，2007，6(6):997-1005.

[4] WANG J，ZHANG Z，WANG Y，et al.PTS1 peroxisomal import pathway plays shared and distinct roles to PTS2 pathway in development and pathogenicity ofMagnaportheoryzae[J].PLoSOne，2013，8(2):e55554.

[5] LI L，WANG J，ZHANG Z，et al.MoPex19，which is essential for maintenance of peroxisomal structure and woronin bodies，is required for metabolism and development in the rice blast fungus[J].PLoSOne，2014，9(1):e85252.

[6] PARK G，BRUNO K S，STAIGER C J，et al.Independent genetic mechanisms mediate turgor generation and penetration peg formation during plant infection in the rice blast fungus[J].MolecularMicrobiology，2004，53(6):1695-1707.

[7] BOURETT T M，HOWARD R J.Invitrodevelopment of penetration structures in the rice blast fungusMagnaporthegrisea[J].CanadianJournalofBotany，1990，68(2):329-342.

[8] HOWARD R J，VALENT B.Breaking and entering:host penetration by the fungal rice blast pathogenMagnaporthegrisea[J].AnnualReviewofMicrobiology，1996，50:491-512.

[9] HOWARD R J，F(xiàn)ERRARI M A，ROACH D H，et al.Penetration of hard substrates by a fungus employing enormous turgor pressures[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，1991，88(24):11281-11284.

[10] DE JONG J C，MCCORMACK B J，SMIRNOFF N，et al.Glycerol generates turgor in rice blast[J].Nature，1997，389(6648):244-244.

[11] LEE Y H，DEAN R A.Hydrophobicity of contact surface induces appressorium formation inMagnaporthegrisea[J].FEMSMicrobiologyLetters，1994，115(1):71-75.

[12] GILBERT R D，JOHNSON A M，DEAN R A.Chemical signals responsible for appressorium formation in the rice blast fungusMagnaporthegrisea[J].PhysiologicalandMolecularPlantPathology，1996，48(5):335-346.

[13] XIAO J Z，WATANABE T，KAMAKURA T，et al.Studies on cellular-differentiation ofMagnaporthegrisea-physicochemical aspects of substratum surfaces in relation to appressorium formation[J].PhysiologicalandMolecularPlantPathology，1994，44(3):227-236.

[14] LIU S，DEAN R A.G protein alpha subunit genes control growth，development，and pathogenicity ofMagnaporthegrisea[J].MolecularPlant-MicrobeInteractions，1997，10(9):1075-1086.

[15] BOLKER M.Sex and crime:heterotrimeric G proteins in fungal mating and pathogenesis[J].FungalGeneticsandBiology，1998，25(3):143-156.

[16] XU J R，HAMER J E.MAP kinase and cAMP signaling regulate infection structure formation and pathogenic growth in the rice blast fungusMagnaporthegrisea[J].Genes&Development，1996，10(21):2696-2706.

[17] ZHAO X，KIM Y，PARK G，et al.A mitogen-activated protein kinase cascade regulating infection-related morphogenesis inMagnaporthegrisea[J].PlantCell，2005，17(4):1317-1329.

[18] LEE Y H，DEAN R A.cAMP regulates infection structure formation in the plant pathogenic fungusMagnaporthegrisea[J].PlantCell，1993，5(6):693-700.

[19] ZHOU X，ZHAO X，XUE C，et al.Bypassing both surface attachment and surface recognition requirements for appressorium formation by overactive ras signaling inMagnaportheoryzae[J].MolecularPlant-MicrobeInteractions，2014，27(9):996-1004.

[20] BROACH J R，DESCHENES R J.The function of ras genes inSaccharomycescerevisiae[J].AdvancesinCancerResearch，1990，54:79-139.

[21] MITCHELL T K，DEAN R A.The cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit is required for appressorium formation and pathogenesis by the rice blast pathogenMagnaporthegrisea[J].PlantCell，1995，7(11):1869-1878.

[22] XU J R，URBAN M，SWEIGARD J A，et al.TheCPKAgene ofMagnaporthegriseais essential for appressorial penetration[J].MolecularPlant-MicrobeInteractions，1997，10(2):187-194.

[23] TODA T，CAMERON S，SASS P，et al.SCH9，a gene ofSaccharomycescerevisiaethat encodes a protein distinct from，but functionally and structurally related to，cAMP-dependent protein kinase catalytic subunits[J].Genes&Development，1988，2(5):517-527.

[24] WARD M P，GARRETT S.Suppression of a yeast cyclic AMP-dependent protein kinase defect by overexpression ofSOK1，a yeast gene exhibiting sequence similarity to a developmentally regulated mouse gene[J].Molecular&CellularBiology，1994，14(9):5619-5627.

[25] POMBO C M，BONVENTRE J V，MOLNAR A，et al.Activation of a human Ste20-like kinase by oxidant stress defines a novel stress response pathway[J].EMBOJournal，1996，15(17):4537-4546.

[26] POMBO C M，TSUJITA T，KYRIAKIS J M，et al.Activation of the Ste20-like oxidant stress response kinase-1 during the initial stages of chemical anoxia-induced necrotic cell death.Requirement for dual inputs of oxidant stress and increased cytosolic [Ca2+][J].JournalofBiologicalChemistry，1997，272(46):29372-29379.

[27] MARTINDALE J L，HOLBROOK N J.Cellular response to oxidative stress:signaling for suicide and survival[J].JournalofCellularPhysiology，2002，192(1):1-15.

[28] EGAN M J，WANG Z Y，JONES M A，et al.Generation of reactive oxygen species by fungal NADPH oxidases is required for rice blast disease[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，2007，104(28):11772-11777.

[29] SKAMNIOTI P，HENDERSON C，ZHANG Z，et al.A novel role for catalase B in the maintenance of fungal cell-wall integrity during host invasion in the rice blast fungusMagnaporthegrisea[J].MolecularPlant-MicrobeInteractions，2007，20(5):568-580.

[30] HUANG K，CZYMMEK K J，CAPLAN J L，et al.HYR1-mediated detoxification of reactive oxygen species is required for full virulence in the rice blast fungus[J].PLoSPathogens，2011，7(4):e1001335.

[31] HUANG K，CZYMMEK K J，CAPLAN J L，et al.Suppression of plant-generated reactive oxygen species is required for successful infection by the rice blast fungus[J].Virulence，2011，2(6):559-562.

[32] TALBOT N J，EBBOLE D J，HAMER J E.Identification and characterization ofMPG1，a gene involved in pathogenicity from the rice blast fungusMagnaporthegrisea[J].PlantCell，1993，5(11):1575-1590.

[33] 李海嬌，盧建平，劉小紅，等.適用于稻瘟病菌基因敲除、過表達和熒光融合蛋白表達載體的構(gòu)建和使用[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2012，20(1):94-104.

LI H J，LU J P，LIU X H，et al.Vectors building and usage for gene knockout，protein expression and fluorescent fusion protein in the rice blast fungus[J].JournalofAgriculturalBiotechnology，2012，20(1):94-104.(in Chinese with English abstract)

[34] WANG J，LI L，ZHANG Z，et al.One of three Pex11 family members is required for peroxisomal proliferation and full virulence of the rice blast fungusMagnaportheoryzae[J].PLoSOne，2015，10(7):e0134249.

MoSOK1，aputativegerminalcenterkinaseencodinggene，isrequiredforfungalgrowth，conidiationandpathogenicityinMagnaportheoryzae

FENG Xiaoxiao1，LI Haijiao2，LI Ling3，4，WANG Jiaoyu3，*，LIN Fucheng1，LU Jianping2，*

(1.StateKeyLaboratoryofRiceBiology，BiotechnologyInstitute，ZhejiangUniversity，Hangzhou310058，China;2.CollegeofLifeScience，ZhejiangUniversity，Hangzhou310058，China;3.InstituteofPlantProtectionandMicrobiology，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310021，China;4.CollegeofAgricultureandFoodScience，ZhejiangAandFUniversity，Hangzhou311300，China)

Abstract:SOK1 is a Ste20 protein kinase of the germinal center kinase(GCK) that is activated by oxidant stress and chemical anoxia.It is unknown so far whetherSOK1 play roles in regulation of the fungal pathogenicity.Herein，we functionally characterized theSOK1 homologue in the rice blast fungusMagnaportheoryzae(MoSOK1).MoSOK1 was up-regulated during conidial germination and appressorial formation.Targeted gene replacement showed thatMoSOK1 acts as a regulator to fungal development and virulence inM.oryzae.Δmosok1 mutants showed decreased vegetative growth and conidiation，delayed conidial germination and a significant reduction in virulence.MoSOK1 was also found related to the sexual reproduction of the fungus.These data implicate thatSOK1 signaling is required for fungal development and pathogenicity in phytopathogenic fungi.

Key words:Magnaportheoryzae;fungal pathogenicity;MoSOK1

中圖分類號：S435.111.4+1

A

文章編號：1004-1524(2018)06-0999-09

收稿日期：2018-01-05

基金項目：國家自然科學(xué)基金(31170136，31371891，31470249)

作者簡介：馮曉曉(1982—)，女，浙江玉環(huán)人，碩士，助理實驗師，主要從事植物真菌病害致病機理及防控研究。E-mail:xxvon@zju.edu.cn

，盧建平，E-mail:jplu@zju.edu.cn；王教瑜，E-mail:wangjiaoyu78@sina.com

10.3969/j.issn.1004-1524.2018.06.16

(責(zé)任編輯張 韻)