孫 心，梁宛楠，姜 宇

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，哈爾濱 150069）

鴨病毒性肝炎（DVH）是幼齡雛鴨的一種高度致死性急性傳染病，特征是發(fā)病急、傳播快、死亡率高，臨診表現(xiàn)角弓反張，病理變化為肝炎和出血[1]。該病常給養(yǎng)鴨場(chǎng)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。鴨肝炎病毒共分為3個(gè)血清型，分別是血清型Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，3個(gè)型相互之間無抗原相關(guān)性[2]。本試驗(yàn)通過對(duì)江蘇省某發(fā)病的養(yǎng)鴨場(chǎng)進(jìn)行病料采集，分離病毒并通過中和試驗(yàn)，RT-PCR試驗(yàn)等試驗(yàn)進(jìn)行鑒定。

1 試驗(yàn)材料

SPF鴨胚及SPF鴨（哈爾濱獸醫(yī)研究所）；Ⅰ型鴨肝炎病毒陽性血清、Ⅲ型鴨肝炎病毒陽性血清；焦碳酸二乙酯（DEPC）、dNTP、rTaq酶、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒以上均為寶生物有限公司；PMD18-T載體、感受態(tài)細(xì)胞（DH5ɑ）（Pro?mega公司）；注射用青霉素鈉（哈藥總廠）；注射用硫酸鏈霉素（山東魯抗限公司）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 病料采集及其處理

無菌采集江蘇省某鴨場(chǎng)病死雛鴨的肝、脾組織，剪碎磨細(xì)，用滅菌生理鹽水按1∶5稀釋成混懸液，過濾后收取濾液，加入氯仿（終濃度為5%），振蕩15 min后，3 000 r·min-1離心20 min，收集上清液，加入雙抗，做為分離接種樣品，并保存于-70℃冰箱備用。

2.2 病毒分離培養(yǎng)

取分離的樣品進(jìn)行培養(yǎng)。用滅菌生理鹽水做100倍稀釋，經(jīng)尿囊腔接種10日齡鴨胚，每胚0.2 mL，置37℃孵化，觀察至168 h。棄去24 h以前死亡的鴨胚，收集24～72 h死亡的鴨胚，無菌吸取鴨胚液，-20℃保存?zhèn)溆?，并觀察鴨胚的病變。

2.3 病毒鑒定

2.3.1 鴨胚中和試驗(yàn)

將病毒液用生理鹽水稀釋至200ELD50/0.2mL，與等量抗鴨肝炎病毒血清Ⅰ型特異性血清混合，置37℃水浴中和1 h。同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照（病毒液與等量生理鹽水混合）。中和組和對(duì)照組經(jīng)尿囊腔各接種10日齡SPF鴨胚5枚，每胚0.2 mL，在37℃孵育觀察168 h，記錄鴨胚死亡情況。

2.3.2 病毒PCR法檢測(cè)

病毒核酸的提取采用SDS-蛋白酶K方法提取鴨胚液中的病毒核酸，然后用TE液懸浮，-20℃保存?zhèn)溆?。參考有關(guān)資料進(jìn)行設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增VP1-VP3區(qū)段蛋白基因，大小為7 144 bp；上游引物P1： 5'-GGTGATTCTAACCAGTTGGG-3'； 下 游 引物 P2：5'-TTCAATTTCCAGATTGAGTTC-3'；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，用滅菌去離子水將引物溶解并稀釋至20 pmol·μL-1。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（50.0 μL）為 10×PCR buffer 5.0 μL；dNTP 4.0 μL；上游引物 1.0 μL；下游引物 1.0 μL；滅菌去離子水35.0 μL；DNA模板 3.0 μL；rTaq酶1.0 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條為95℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10 min，4℃終止循環(huán)，將擴(kuò)增得到的產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳，電流30 mA，電壓100 V，25 min，同時(shí)與DNA Marker DL2 000進(jìn)行比較，即可得出試驗(yàn)結(jié)果[3]。

2.3.3 VP3基因序列分析

將PCR擴(kuò)增的病毒VP1基因在16℃下連接到PMD18-T載體上，連接體系為：PMD18-T載體0.5 μL、SolutionⅠ15 μL、目的片段4.5 μL。連接時(shí)間為15 h，再將獲得的產(chǎn)物10 μL全部加入100 μL的感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，于37℃搖床培養(yǎng)1 h，涂布于AMP+LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)6～18 h，挑取白色菌落于LB液體培養(yǎng)基中，37℃擴(kuò)增培養(yǎng)12 h，用試劑盒提取質(zhì)粒，鑒定陽性后，將含有陽性重組子的菌液寄送生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序，應(yīng)用DNAStar和MEGA4.0軟件進(jìn)行核苷酸序列分析。獲得的序列與標(biāo)準(zhǔn)株及genebank上公布的部分分離株進(jìn)行比對(duì)。參考序列見表1。

2.3.4 動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)

取分離樣品，做10倍稀釋，取4日齡SPF雛鴨20只，分成兩組，第1組每只頸部皮下注射江蘇株病毒液0.2 mL；第2組不接種病毒作為對(duì)照，觀察并記錄雛鴨臨床表現(xiàn)及死亡情況。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 鴨胚分離培養(yǎng)結(jié)果

鴨胚分離培養(yǎng)結(jié)果見表2。鴨胚病變情況見圖1～2。

由表2可知，分離的病毒經(jīng)鴨胚傳代培養(yǎng)F2代以后，全部鴨胚于30～72 h死亡，對(duì)照組無死亡。剖檢鴨胚可見鴨胚全身出血見圖1，肝臟變性見圖2，對(duì)照組鴨胚無明顯變化。

表2 鴨胚死亡結(jié)果

圖1 接種后鴨胚死亡情況

圖2 鴨胚肝臟病變

2.2 鴨胚中和試驗(yàn)結(jié)果

交叉中和試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)血清交叉中和試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，分離株可被Ⅰ型DHV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清完全中和，Ⅲ型DHV陽性血清對(duì)分離株無中和作用。剖檢死亡鴨胚均呈胚體水腫、出血，肝臟出血等典型病變，存活鴨胚均無病變。

2.3 分離病毒的PCR檢測(cè)

分離病毒的PCR檢測(cè)見圖3。

圖3 PCR檢測(cè)圖

由圖3可知，通過Ⅰ型鴨肝炎病毒特異性引物和相應(yīng)的RT-PCR試驗(yàn)，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，約在714 bp處出現(xiàn)了特異性的DNA條帶。

將特異性條帶鏈接T載體后送到上海生工進(jìn)行測(cè)學(xué)，所得到的結(jié)果在GenBank進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)與DRL-62同源性高達(dá)97.1%?？膳卸ǚ蛛x毒為Ⅰ型鴨甲型肝炎病毒。

2.4 動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)

2.4.1 雛鴨死亡情況

雛鴨死亡情況見表4。

由表4可知，分離株10倍稀釋的病毒液，每只0.2 mL，接種4日齡SPF雛鴨10只，觀察期內(nèi)雛鴨90%死亡。

2.4.2 雛鴨臨床表現(xiàn)

雛鴨臨床表現(xiàn)見圖4。

由圖4可知，接種分離株的死亡雛鴨呈現(xiàn)DVH典型癥狀角弓反張，雛鴨剖檢可見肝臟出血、腫大和變性，對(duì)照組雛鴨健康。

表4 雛鴨死亡情況

圖4 雛鴨臨床表現(xiàn)

4 討論

病毒的分離首先將疑似帶有病毒而待分離的標(biāo)本，例如發(fā)生病變的組織經(jīng)過處理后接種于細(xì)胞或敏感的試驗(yàn)宿主進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時(shí)間后，通過檢查病毒特異性病理表現(xiàn)或用其他方法來肯定病毒的存在。不同病毒的繁殖方式不同，DHV通過在鴨胚內(nèi)培養(yǎng)增殖后，鴨胚死亡，剖檢鴨胚發(fā)現(xiàn)肝臟腫大并有出血點(diǎn)、肝上有壞死病灶，因此可以進(jìn)行初步的判斷。其次通過動(dòng)物回歸試驗(yàn)進(jìn)行鑒定，DHV多易感染雛鴨，特別是1～2周齡，死亡快，并且病鴨呈現(xiàn)角弓反張等癥狀，因此臨床上對(duì)該病的判斷十分容易。初步確定病毒種屬后，鑒別DHV的血清型。雖然國內(nèi)外已設(shè)計(jì)了多種不同的方法檢測(cè)DHV抗原或抗體，不過截止到目前，中和試驗(yàn)依舊是鑒定DHV的主流方法；使用DHV抗血清免疫雛鴨后再通過待檢毒株攻毒，也能夠達(dá)到鑒定待檢病毒的效果。然而，如果待檢病毒中存在多種血清型，那么中和試驗(yàn)依舊是首選之法。最后運(yùn)用分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，將分離得病毒用試劑盒提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行RT-PCR，核酸電泳觀察電泳結(jié)果，判斷分離病毒與已知病毒之間的同源性，得出結(jié)論，再進(jìn)行基因序列分析，構(gòu)建進(jìn)化樹進(jìn)行系統(tǒng)鑒定[4]。RT-PCR檢測(cè)技術(shù)具有靈敏度高、簡便、快速、安全等特點(diǎn)，易于推廣，對(duì)標(biāo)本的純度要求較低，無需分離病毒即可檢測(cè)[5]。

本試驗(yàn)通過接種鴨胚，病料經(jīng)尿囊腔連續(xù)傳代死亡率均達(dá)100%，其死亡時(shí)間主要集中在72～90 h，接種的鴨胚均能呈現(xiàn)鴨病毒性肝炎的典型癥狀。同時(shí)將分離毒株F2含毒尿囊液接種4日齡雛鴨，引起雛鴨發(fā)病并在3 d內(nèi)全部死亡，臨床癥狀表現(xiàn)為角弓反張剖檢發(fā)現(xiàn)肝臟出血腫大，與陳溥言研究結(jié)果大體一致[1]。因此可以初步判定分離的流行株屬于鴨肝炎病毒。通過中和試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)分離株與Ⅰ型特異性血清混合后接種鴨胚不死亡，與Ⅲ型特異性血清混合后接種鴨胚全部死亡，通過實(shí)驗(yàn)可以表明江蘇病毒株為Ⅰ型DHV，對(duì)血清型也得到初步的結(jié)論。為了更有效的驗(yàn)證，本試驗(yàn)進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)，分析每種類型毒株的VP1堿基序列或者aa序列的相似程度，就可以對(duì)DHV所屬的血清型進(jìn)行判斷[6]。Chen等研究表明，按照檢測(cè)到的DHV-1對(duì)應(yīng)的RNA堿基分布，借助Rre?mier5.0制備出相應(yīng)的上下游引物，公布了用于檢測(cè)DHV的RT-PCR技術(shù)[7]。通過提取病毒培養(yǎng)液中的RNA，根據(jù)GenBank中收錄的DHV基因序列，針對(duì)保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)引物，經(jīng)過一系列反應(yīng)擴(kuò)增出預(yù)期的特異性條帶。利用DNAStar軟件與標(biāo)準(zhǔn)毒株及genebank上公布的部分與分離株進(jìn)行對(duì)比分析并構(gòu)建進(jìn)化樹，表明分離株為Ⅰ型DHV。本試驗(yàn)通過從當(dāng)?shù)匾咔榉蛛x出病毒進(jìn)行鑒定，為以后開展該病的防控提供依據(jù)。

[1] 陳溥言.獸醫(yī)傳染病學(xué)（第五版）[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,2006.

[2] 馮永勝,衣服德,陳正平.鴨病毒性肝炎病毒的分離與鑒定[J].山東畜牧獸醫(yī),2014,35（6）：54-55.

[3] 耿昕穎,劉艷萍,張福君,等.鴨肝炎病毒PCR-ELISA檢測(cè)方法的建立[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2016,46（2）：161-166.

[4] 于新友,李天芝,沈志強(qiáng).分子生物學(xué)技術(shù)在鴨肝炎病毒檢測(cè)中應(yīng)用研究進(jìn)展[J].家禽科學(xué),2015（9）：51-54.

[5] 胡成,朱善元,左偉勇,等.鴨Ⅰ型肝炎病毒一步法RT-LAMP可視化快速檢測(cè)方法的建立[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2015（3）：613-618.

[6] 張建坡.新型鴨肝炎病毒的分離鑒定及生物學(xué)特性分析[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué),2014.

[7] Chen L L,Xu Q,Zhang R H,et al.Improved duplex RT-PCR as?say for differential diagnosis of mixed infection of duck hepatitis A virus type 1 and type 3 in ducklings[J].Journal of Virological Methods,2013,192（1-2）：12-17.