響應(yīng)面法優(yōu)化煙梗中煙堿提取

張志平，李元清，劉建國，宋麗麗

（1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院煙草行業(yè)煙草工業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，河南鄭州 450001；2.浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，浙江杭州 310024）

0 引言

煙梗是煙葉的重要組成部分，經(jīng)過梗葉分離后可制得占煙葉質(zhì)量25%～30%的煙梗，我國每年可生產(chǎn)約70×104t煙梗[1]。目前，煙梗主要被用于制造在卷煙中添加的煙用梗絲和再造煙葉[2]，但由于煙梗自身的特點，在卷煙中使用率并不高，仍有1/3被廢棄[3]。煙梗與煙葉中的化學(xué)成分基本相同，但含量差異顯著[4]，其中煙堿是煙梗中含有的一種生物堿，為二元弱堿，多與檸檬酸或蘋果酸形成化合物存在于煙草和煙梗中[5]。煙堿在醫(yī)藥[6-8]、農(nóng)業(yè)[7-9]、化工、煙草工業(yè)等領(lǐng)域有較大的應(yīng)用價值，目前市場中的煙堿產(chǎn)品主要有純度為40%的硫酸煙堿和95%以上的純煙堿[10]。國內(nèi)外對煙堿的提取工藝與應(yīng)用有較多研究，大部分報道均是采用煙葉作為提取原料[11-12]，而有關(guān)煙梗中煙堿的提取工藝鮮有報道。

目前，從煙草中提取煙堿的方法有離子交換法、水蒸氣蒸餾法、萃取法等[13]。為了優(yōu)化煙梗中煙堿的提取工藝，以煙堿提取量為考查指標(biāo)，以水為提取溶劑，通過水浴時間、水浴溫度、溶劑pH值、提取次數(shù)、料液比等單因素試驗，進(jìn)一步采用PB試驗對試驗因素進(jìn)行篩選，在最陡爬坡試驗的基礎(chǔ)上，完成中心組合試驗（CCD），確定水提取煙梗中煙堿的最佳提取工藝，為煙梗中煙堿的提取提供工藝參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

煙梗，來自福建地區(qū)，為2016年長梗；煙堿標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司，純度＞99%）；NaOH（AR）、甲醇（SR）、超純水、磷酸氫二鈉（AR）、磷酸（AR）等。

BS201S型分析天平、BCD-275MBC型冰箱、ST-07B型粉碎機(jī)、離心機(jī)、鼓風(fēng)干燥機(jī)、PHS-3C型pH計、Agilent7820A型高效液相色譜儀、DZKW-4型電熱恒溫水浴鍋等。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料的預(yù)處理

將煙梗去除雜質(zhì)，放入干燥箱中于105℃條件下干燥至恒質(zhì)量。

1.2.2 煙堿的提取

準(zhǔn)確稱取干燥至恒質(zhì)量的煙梗5 g于250 mL的三角瓶中，加入提取溶劑水，在一定條件下進(jìn)行水浴提取，然后常規(guī)濾紙過濾、定容，取2 mL濾液，以轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL經(jīng)0.45 μm水系濾膜過濾，然后進(jìn)行高效液相色譜測定。

1.2.3 煙堿的測定

（1） 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。以煙堿標(biāo)準(zhǔn)品為對照，采用高效液相色譜法測定煙堿，色譜條件為色譜柱：Symmetry C18（250.0 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流動相為V1（甲醇）：V2（0.02 mol/L磷酸氫二鈉緩沖溶液pH值6.0） =70∶30；檢測波長259 nm；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30℃。煙堿質(zhì)量濃度X與色譜峰面積Y建立回歸方程為：Y=13 162X（R2=0.999 6）。

（2）樣品中煙堿提取量的測定。取1.2.2中過水系濾膜后的濾液進(jìn)行液相色譜測定，記錄峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出濾液中煙堿的質(zhì)量濃度C，進(jìn)而求出煙堿的提取量。煙堿的提取量按公式（1）計算。

式中：C——提取液中煙堿的質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——提取液的體積，mL；

m——樣品的質(zhì)量，g。

1.2.4 煙堿提取條件的初步確定

采用單因素試驗研究溶劑pH值、水浴溫度、水浴時間、料液比對煙堿提取量的影響。按照1.2.2中的提取步驟，分別進(jìn)行試驗測定。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化煙梗中煙堿的提取條件

（1） 全因子試驗設(shè)計（DOE）[14]。在單因素試驗的基礎(chǔ)上進(jìn)行全因子試驗設(shè)計，對溶劑pH值、水浴溫度、水浴時間、料液比4個因素，以煙堿提取量為響應(yīng)值進(jìn)行二水平的試驗，篩選對提取率有顯著影響的因素。

全因子試驗的因素與水平設(shè)計見表1。

表1 全因子試驗的因素與水平設(shè)計

（2）最陡爬坡試驗[15]。根據(jù)全因子試驗的結(jié)果，選擇顯著因素，根據(jù)方程的回歸系數(shù)的符號和大小，設(shè)計關(guān)于顯著因素的最陡爬坡方向與步長，有效逼近最大理想?yún)^(qū)域。

（3） 中心組合設(shè)計[16]。以全因子試驗確定的顯著因素，結(jié)合最陡爬坡確定的最佳試驗組合，以該組合為中心點進(jìn)行響應(yīng)面分析。

中心組合設(shè)計的因素與水平設(shè)計見表2。

表2 中心組合設(shè)計的因素與水平設(shè)計

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 溶劑pH值對煙堿提取量的影響

單因素試驗結(jié)果見圖1。

煙堿的提取量在酸性和堿性條件下均具有較高的提取量，在酸性條件下，煙堿以煙堿鹽的形式存在，酸性越強(qiáng)，溶解在水中的煙堿鹽越多，在堿性條件下，煙堿鹽可解離為游離煙堿，增大溶液的堿性，有利于煙堿鹽解離成游離煙堿[4]。由圖1（a） 可知，在堿性條件下，隨著溶劑pH值的增大而提高，當(dāng)溶劑pH值超過11后，煙堿的提取量趨于平衡。最佳溶劑pH值為11時煙堿的最大提取量為4.012 mg/g。

2.1.2 水浴溫度對煙堿提取量的影響

由圖1（b）可知，煙堿提取量隨著水浴溫度的升高而提高，當(dāng)水浴溫度超過50℃后煙堿的提取量反而下降，因為溫度超過一定值后，煙堿和水溶液的互溶效果降低，導(dǎo)致提取量的下降，因此最佳水浴溫度為50℃時煙堿的最大提取量為4.101 mg/g。

2.1.3 水浴時間對煙堿提取量的影響

由圖1（c） 可知，煙堿的提取量隨水浴時間的增加而提高，在1 h后煙堿的提取量趨于平衡，根據(jù)固液傳質(zhì)理論，在提取初期，也就是在0～1 h擴(kuò)散作用居主導(dǎo)地位，固液傳質(zhì)中存在濃度平衡，在1 h之后，煙堿的提取量趨于平衡，因此，最佳水浴時間為1 h時煙堿的最大提取量為4.101 mg/g。時間（C）、料液比4個因素對煙堿提取量的影響，以煙堿提取量為響應(yīng)值。

圖1 單因素試驗結(jié)果

全因子試驗設(shè)計結(jié)果見表3。

表3 全因子試驗設(shè)計結(jié)果

根據(jù)表3中的結(jié)果進(jìn)行回歸模型方差分析，得到的回歸方程為Y=3.816 8-0.056 7A+0.200 6B+0.167 1C+0.144 1D，其中，p<0.001，R2=0.916 4，因此該模型擬合效果較好。

全因子試驗設(shè)計的主效應(yīng)分析見表4。

表4 全因子試驗設(shè)計的主效應(yīng)分析

2.1.4 料液比對煙堿提取量的影響

由圖1（d）可知，料液比對煙堿提取量有較大的影響，隨著料液比的增加，煙堿提取量也逐漸增大。推測原因：隨著料液比加大，料液之間的濃度差也逐漸加大，導(dǎo)致煙堿向溶劑中轉(zhuǎn)移。料液比超過1∶25后，煙堿提取量趨于平緩，考慮節(jié)約溶劑的因素，選擇最佳料液比為1∶25，煙堿提取量為4.348 mg/g。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化煙梗中煙堿的提取工藝

2.2.1 全因子試驗（DOE） 設(shè)計結(jié)果

依據(jù)單因素試驗結(jié)果，進(jìn)行全因子試驗（DOE）設(shè)計，考查溶劑pH值（A）、水浴溫度（B）、水浴

由表4可以得到，對煙堿提取量影響顯著的因素分析為水浴溫度、水浴時間和料液比。

2.2.2 最陡爬坡試驗設(shè)計

根據(jù)2.2.1得到的回歸方程和表3的分析結(jié)果設(shè)計最陡爬坡的方向和步長，水浴溫度、水浴時間、料液比對煙堿提取量的影響顯著，而且三者的系數(shù)均為正，說明增加三者的水平可以增加煙堿的提取量，以單因素試驗的中心點為出發(fā)點，設(shè)計最陡爬坡試驗。

煙堿提取的最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果見表5。

2.2.3 中心旋轉(zhuǎn)組合（CCD）試驗設(shè)計及結(jié)果

以最陡爬坡試驗的最優(yōu)值所對應(yīng)的組合為中心點，進(jìn)行中心旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計，共20個試驗點。

中心組合試驗設(shè)計（CCD）結(jié)果見表6。

利用Minitab對表中數(shù)據(jù)做回歸分析和擬合優(yōu)化，得到響應(yīng)面回歸模型為：

表5 煙堿提取的最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果

表6 中心組合試驗設(shè)計（CCD）結(jié)果

式中：Y——煙堿提取量。

中心組合試驗設(shè)計（CCD）方差分析見表7。

由表7可知，模型的F值為8.77，p<0.001，模型極顯著，失擬項p值為0.252，失擬項不顯著，其R2為0.887 6，響應(yīng)值的變化有88.76%來源于所選因素，表明方程擬合度較好，因此模型具有實際應(yīng)用意義。

從表7中可以看出，B，C，D，B2，D2對Y值有顯著影響，可見試驗因素對煙堿提取量的影響不是簡單的線性關(guān)系，各因素對煙堿提取量的影響大小順序為料液比＞水浴溫度＞水浴時間。

2.2.4 響應(yīng)曲面擬合和最佳試驗點的確定

為了更直觀地觀察各因素和各因素間的交互作用，利用Minitab軟件做出回歸方程中交互項的響應(yīng)曲面圖與等值線圖。

水浴溫度和水浴時間對煙堿提取量的影響見圖2，水浴溫度與料液比對煙堿提取量的影響見圖3，水浴時間與料液比對煙堿提取量的影響見圖4。

表7 中心組合試驗設(shè)計（CCD）方差分析

圖2 水浴溫度和水浴時間對煙堿提取量的影響

由圖2可知，在料液比不變的前提下，水浴時間一定，隨水浴溫度的提高，煙堿提取量迅速增大，然后迅速減小；水浴溫度一定，隨著水浴時間的延長，煙堿的提取量先增加后緩慢降低，說明水浴時間對煙堿提取量的影響比水浴溫度大。由圖3可知，在水浴時間不變的前提下，水浴溫度一定，隨著料液比的增大，煙堿的提取量先增加后緩慢降低；料液比一定，隨著水浴溫度的升高，煙堿的提取量先增加后迅速降低，說明料液比對煙堿提取量的影響比水浴溫度大。由圖4可知，在水浴溫度不變的前提下，料液比一定，隨著水浴時間的延長，煙堿的提取量先增加后降低；水浴時間一定，隨著料液比的增大，煙堿的提取量先增加后緩慢降低，說明料液比對煙堿提取量的影響比水浴時間大。3個因素對煙堿提取量影響的先后順序為料液比、水浴時間和水浴溫度。

圖3 水浴溫度與料液比對煙堿提取量的影響

圖4 水浴時間與料液比對煙堿提取量的影響

通過中心旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計對試驗進(jìn)行結(jié)果優(yōu)化，利用Minitab軟件求解響應(yīng)面方程最大值，結(jié)果見圖5，得出最佳提取工藝為水浴溫度52.3℃，水浴時間69.01 min，料液比1∶29.8（g∶mL），溶劑pH值為11。在此條件下得到煙堿的提取量預(yù)測值為4.591 1 mg/g。

響應(yīng)面方程最優(yōu)組合見圖5。

圖5 響應(yīng)面方程最優(yōu)組合

2.3 驗證試驗

為檢驗響應(yīng)面所得結(jié)果的可靠性，采用上述得到的最佳提取工藝組合進(jìn)行煙梗煙堿成分的提取?？紤]到試驗的進(jìn)行，將最佳工藝條件修改為水浴溫度 52℃，水浴時間 70 min，料液比 1∶30（g∶mL），pH值11，在此條件下對煙梗中的煙堿進(jìn)行提取，煙堿的提取量為4.522±0.051 mg/g，與預(yù)測值相差僅為1.5%，預(yù)測值可靠，說明試驗結(jié)果與模型符合良好，基于響應(yīng)面法分析所得的優(yōu)化提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實際參考價值。

3 結(jié)論

以煙梗為原料，通過單因素試驗，系統(tǒng)研究溶劑pH值、水浴時間、水浴溫度和料液比對煙梗煙堿提取量的影響。利用Minitab進(jìn)行全因子試驗設(shè)計（DOE）、最陡爬坡試驗和中心旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計（CCD），得出水溶劑提取煙梗中煙堿成分的最佳提取工藝為水浴溫度52℃，水浴時間70 min，料液比1∶30（g∶mL），溶劑pH值11，在此條件下，煙堿提取量為4.522±0.051 mg/g，與預(yù)測值基本相符，因此經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后的提取條件是可行的。試驗為煙梗資源化利用提供了一條途徑。

[1]李曉，紀(jì)曉楠，姚二民，等.煙用梗絲加工工藝研究進(jìn)展 [J]．貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（8）：182-186．

[2]于建軍．卷煙工藝學(xué) [M]．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2009：75-80．

[3]張永良，周曉微，梁萌．煙梗綜合利用研究進(jìn)展 [J]．現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2016（8）：232-234．

[4]韓富根．煙草化學(xué) [M]．第2版．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2010：33-40．

[5]馬俊勃．煙堿提取的研究進(jìn)展 [J]．廣東化工，2011，38（10）：72-73．

[6]White H E.Four-week nicotine skin patch treatment effects on cognitive performance in Alzheimer's disease[J].Psychopharmacology，1999 （7）：158-165.

[7]Levin E J.Nicotine-haloperidol interactions and cognitive performance in schizophrenia[J].Neuropsychopharmacology，1996，15 （5）：429-436.

[8]Masato S，Mari S，Hirofumi M.Nicotinic regulation of experience-dependent plasticity in visual cortex[J].Journal of Physiology，Paris，2016 （1/2）：29-36.

[9]劉智.淺析煙堿類殺蟲劑及其市場走勢 [J].農(nóng)藥市場信息，2017（22）：34-34.

[10]袁菊如，徐國良.煙堿提取方法探討 [J].江西化工，2013 （2）：12-14.

[11]吳映捷，呂新美，閆兵兵，等.響應(yīng)面法優(yōu)化酶輔助提取廢棄煙葉中煙堿 [J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2017（2）：203-209.

[12]米爾扎提·麥麥提，爾西丁·買買提，喀日耶姆·艾海提，等.正交試驗優(yōu)化逆三相膜萃取煙堿的工藝研究 [J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2016（11）：1 436-1 439.

[13]張先海，史麗巖，史景明.煙堿的研究現(xiàn)狀 [J].海峽藥學(xué)，2010，22（11）：16-18.

[14]Deka D，Bhargavi P，Sharma A，et al.Enhancement of cellulase activity from a new strain of bacillus subtilis by medium optimization and analysis with various cellulosic substrates[J].Enzyme Research，2011（5）：151 656-151 662.

[15]顧華杰，孫燕，李良智，等.響應(yīng)面法優(yōu)化熱水浸提灰樹花多糖的工藝研究 [J].食品工業(yè)科技，2013（19）：234-238，243.

[16]張霞忠，王丹，董垠紅，等.中心組合設(shè)計優(yōu)化超聲提取檸檬籽中的檸檬苦素 [J].中成藥，2016（7）：1 500-1 504.◇