超聲波輔助法提取火龍果果皮多糖工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

但德苗，余 俠，胡珊珊，錢時權(quán)，伍亞華

（蚌埠學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，安徽蚌埠 233030）

火龍果屬仙人掌科，原產(chǎn)于中美洲，后傳入中國，是熱帶、亞熱帶水果。火龍果果皮中含有大量植物多糖[1]，研究表明，植物多糖具有多種生物活性，如抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、降血糖、抑菌等[2-5]。目前，已有對火龍果果莖和果肉[6-7]多糖方面的文獻報道，而關(guān)于火龍果果皮多糖提取方面的研究還未曾有過報道。

植物多糖的提取方法主要有熱水浸提法、超聲波輔助法和微波輔助法等。超聲波輔助法主要利用超聲波的空化和機械效應(yīng)來破壞植物細(xì)胞壁，加快細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)的溶出，具有提取時間短和提取效率高等特點。以火龍果果皮為原料，研究火龍果果皮超聲波輔助法提取工藝，并對提取得到的火龍果多糖體外抗氧化活性進行評價，以期為火龍果果皮副產(chǎn)物資源的高效開發(fā)利用提供理論和技術(shù)參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

火龍果、菜籽油，購于蚌埠華運超市；無水乙醇、30%過氧化氫、硫酸亞鐵、葡萄糖、水楊酸、苯酚、濃硫酸、（2,2'-聯(lián)氮基雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸） 二銨鹽（ABTS）、過硫酸鉀、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT），均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16B型高速離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；FS-4501V型超聲波萃取儀，上海生析超聲儀器有限公司產(chǎn)品；752型紫外可見分光光度計，上海光學(xué)儀器廠產(chǎn)品；FA2004B型電子分析天平，上海精密儀器儀表有限公司產(chǎn)品。

2 試驗方法

2.1 火龍果果皮多糖的提取

選取新鮮的火龍果皮，充分洗滌后，在60℃條件下烘制至恒質(zhì)量粉碎，過60目篩制成粉末；準(zhǔn)確稱取5.00 g火龍果果皮粉末置于錐形瓶中，加入適量蒸餾水；置于超聲波萃取儀中，在一定功率下提取多糖，萃取后的多糖溶液以轉(zhuǎn)速6 000 r/min離心10 min，獲得上清液；向上清液中加入3倍體積的無水乙醇，于4℃條件下醇沉12 h；以轉(zhuǎn)速6 000 r/min離心10 min，收集沉淀，經(jīng)真空干燥后，得到火龍果果皮多糖粉末。

2.2 火龍果果皮多糖提取率的測定

精密稱取干燥的葡萄糖10.00 mg，定容至100 mL，配制成0.10 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液；分別準(zhǔn)確吸取質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0，0.10，0.30，0.50，0.70，0.90，1.10 mL于 7支刻度試管中，加蒸餾水至2.0 mL；再向7支刻度試管中分別加入5%的苯酚溶液1.0 mL，搖勻后迅速加入5.0 mL濃硫酸，沸水浴加熱15 min，冷卻至室溫，并以蒸餾水做空白對照，于波長490 nm處測定吸光度；以葡萄糖質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線（Y=0.129 5X-0.114 2；R2=0.999 7）；量取2.0 mL火龍果果皮多糖供試液，按上述方法測定吸光度，計算多糖含量。按照以下公式計算火龍果皮多糖提取率。

式中：C——供試液的多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；

A——供試液總體積，mL；

n——稀釋倍數(shù)；

a——測定供試液的體積，mL；

M——火龍果果皮粉末的質(zhì)量，g。

2.3 火龍果果皮多糖超聲波輔助提取單因素試驗

2.3.1 料液比對火龍果果皮多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取火龍果果皮粉3.00 g，在保持其他條件不變時，分別選取料液比1∶4，1∶6，1∶8，1∶10，1∶12（g∶mL），按照2.1和2.2方法提取火龍果果皮多糖，計算火龍果果皮多糖提取率，考查料液比對火龍果果皮多糖提取率的影響。

2.3.2 超聲功率對火龍果果皮多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取火龍果果皮粉3.00 g，在保持其他條件不變時，分別選取超聲波功率60，80，100，120，140 W，按照2.1和2.2方法提取火龍果果皮多糖，計算火龍果果皮多糖提取率，考查超聲功率對火龍果果皮多糖提取率的影響。

2.3.3 超聲時間對火龍果果皮多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取火龍果果皮粉3.00 g，在保持其他條件不變時，分別選取超聲時間15，20，25，30，35 min，按照2.1和2.2方法提取火龍果果皮多糖，計算火龍果皮多糖提取率，考查超聲時間對火龍果果皮多糖提取率的影響。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取料液比（X1）、超聲功率（X2）和超聲時間（X3）3個因素，以火龍果果皮多糖提取率（Y）為響應(yīng)值，采用Box-Behnken試驗設(shè)計方法優(yōu)化火龍果果皮多糖超聲輔助提取工藝參數(shù)。

試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 試驗因素與水平設(shè)計

2.5 火龍果果皮多糖體外抗氧化活性試驗

2.5.1 ABTS自由基的清除能力

ABTS自由基清除能力的測定參考文獻[8]，并略做修改。準(zhǔn)確量取等體積濃度為7.4 mmol/L ABTS自由基和濃度為2.6 mmol/L過硫酸鉀溶液，暗處反應(yīng)15 h后，用磷酸緩沖液（pH值7.4） 適當(dāng)稀釋ABTS自由基。分別取3.0 mL不同質(zhì)量濃度的多糖溶液（0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mg/mL） 與 6.0 mL ABTS自由基稀釋液混合均勻，于室溫下反應(yīng)8 min后，同時以VC為對照，分別以6.0 mL蒸餾水代替ABTS自由基稀釋液作為本底和空白對照。于波長752 nm處測定吸光度，計算ABTS自由基清除率。

式中：A0——空白對照吸光度；

A1——樣品吸光度；

A2——本底吸光度。

2.5.2 油脂抗氧化能力

參照文獻[9]進行，并略做修改，稱取5.0 g菜籽油作為油樣，將3.0 mL多糖溶液（1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mg/mL） 加入到油樣中，于70℃烘箱中強化60 min，同時以BHT為對照。采用碘量法按國標(biāo)GB/T 5538—2005測定菜籽油的過氧化值（POV）。

式中：M——碘生成物質(zhì)的量，mmol；

m——油脂質(zhì)量，kg。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗

3.1.1 料液比對火龍果果皮多糖提取率的影響

料液比對火龍果果皮多糖提取率的影響見圖1。

圖1 料液比對火龍果果皮多糖提取率的影響

從圖1可以看出，隨著料液比的增加，火龍果果皮多糖提取率呈先升高后降低的趨勢。在料液比為1∶8時，火龍果果皮多糖提取率達到最大，隨后逐漸降低。因此，料液比選擇1∶8較為適宜。

3.1.2 超聲功率對火龍果果皮多糖提取率的影響

超聲功率對火龍果果皮多糖提取率的影響見圖2。

圖2 超聲功率對火龍果果皮多糖提取率的影響

由圖2可知，火龍果果皮多糖提取率隨超聲功率增加而提高，這可能是因為隨著超聲功率的增加，超聲波的空穴、機械和熱作用增強而多糖溶出速率加快。在超聲功率為100 W時火龍果果皮多糖提取率達到最大值，而超聲功率100 W之后火龍果果皮多糖的提取率維持不變。因此，應(yīng)控制超聲功率在100 W為宜。

3.1.3 超聲時間對火龍果果皮多糖提取率的影響

超聲時間對火龍果果皮多糖提取率的影響見圖3。

圖3 超聲時間對火龍果果皮多糖提取率的影響

由圖3可知，不難發(fā)現(xiàn)，火龍果果皮多糖提取率隨著超聲時間的延長而增加，當(dāng)超聲時間超過25 min后，火龍果果皮多糖提取率呈平緩下降趨勢。超聲波在工作時會產(chǎn)生強烈的剪切作用，而這可能會使多糖分子遭到破壞，從而影響火龍果果皮多糖的提取效率。由此，控制超聲時間以25 min為宜。

3.2 優(yōu)化火龍果果皮多糖提取工藝

綜合分析單因素試驗結(jié)果，選取料液比（X1，g∶mL）、超聲功率 （X2，W） 和超聲時間 （X3，min）為自變量，以火龍果果皮多糖提取率（Y，%）為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面優(yōu)化。

響應(yīng)面試驗結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

根據(jù)表2的結(jié)果，建立火龍果果皮多糖提取率對料液比、超聲功率和超聲時間二次多元回歸方程為：

根據(jù)表2結(jié)果，進行方差分析。

方差分析見表3。

由表2和表3可知，模型（p<0.01） 極顯著。由F值大小可知，影響紅皮火龍果果皮多糖提取率主要因素主次順序為 X2＞X1＞X3，即超聲功率＞料液比＞超聲時間。 由p值可知，一次項X1，X2和X3極顯著（p<0.01），即料液比、超聲功率和超聲時間對火龍果果皮多糖提取率影響極顯著。交互項X2X3影響顯著（p<0.05）和二次項（X12，X22，X32）影響均極顯著（p<0.01），失擬項p=0.095 2＞0.05，說明失擬項不顯著，該模型的擬合度較好。R2=0.991 3，表明此模型能解釋99.93%的響應(yīng)變化。上述結(jié)果表明，所得到的回歸方程能很好地預(yù)測火龍果果皮多糖提取率與料液比、超聲功率和超聲時間各因素間的關(guān)系。

3.3 響應(yīng)面分析

料液比（X1，g∶mL） 和超聲功率（X2，W） 對火龍果果皮多糖提取率的影響見圖4，料液比（X1，g∶mL） 和超聲時間（X3，min） 對紅龍果果皮多糖提取率的影響見圖5，超聲功率（X2，W）和超聲時間（X3，min）對紅龍果果皮多糖提取率的影響見圖6。

表3 方差分析

圖4 料液比（X1，g∶mL） 和超聲功率（X2，W） 對火龍果果皮多糖提取率的影響

圖5 料液比（X1，g∶mL） 和超聲時間（X3，min） 對紅龍果果皮多糖提取率的影響

圖6 超聲功率（X2，W） 和超聲時間（X3，min） 對紅龍果果皮多糖提取率的影響

圖4 ～圖6反映了料液比（X1）、超聲功率（X2）和超聲時間（X3）對火龍果果皮多糖提取率的交互影響。由圖4可知，當(dāng)超聲時間固定時，料液比曲面的變化幅度要低于超聲功率，說明超聲波功率對多糖提取率的影響較大。等高線圖為圓形，表明料液比和超聲功率對火龍果果皮多糖提取率的交互作用不顯著。由圖5可知，當(dāng)超聲功率固定時，超聲時間曲面變化幅度低于料液比，說明料液比對火龍果果皮多糖提取率的影響較大；等高線圖表明，料液比和超聲功率交互作用不顯著。由圖6可知，當(dāng)料液比固定時，超聲功率曲面的變化幅度大于超聲時間曲面的變化幅度，說明超聲功率對火龍果果皮多糖提取率的影響較大；等高線圖接近橢圓形，說明超聲功率和超聲時間對火龍果果皮多糖提取率交互影響較顯著。

根據(jù)建立的數(shù)學(xué)回歸模型，進行參數(shù)的最優(yōu)化分析，得出火龍果果皮多糖超聲波輔助提取的最佳條件為料液比1∶8，超聲功率101.30 W，超聲時間26.10 min；在此工藝條件下，得到火龍果果皮多糖提取率的最大預(yù)測值為13.9%?？紤]到實際操作情況，對最佳條件進行了適當(dāng)調(diào)整：料液比1∶8，超聲功率101 W，超聲時間26 min，在此工藝條件下，進行3次重復(fù)試驗，得到紅皮火龍果果皮多糖的實際提取率為13.88%，平均誤差為1.52%（n=3），試驗值與理論值基本吻合。以上結(jié)果表明，所獲得的模型能有效用于火龍果果皮多糖的超聲波輔助提取。

3.4 火龍果果皮多糖的體外抗氧化活性

3.4.1 ABTS自由基清除能力

火龍果果皮多糖對ABTS自由基的清除能力見圖7。

圖7 火龍果果皮多糖對ABTS自由基的清除能力

由圖7可知，不難發(fā)現(xiàn)，火龍果果皮多糖對ABTS自由基有明顯的清除作用。隨著火龍果果皮多糖質(zhì)量濃度的增加，ABTS自由基清除率逐漸增強（p<0.01）。當(dāng)質(zhì)量濃度超過為2.0 mg/L時，火龍果果皮多糖對ABTS自由基的清除率與VC差異不顯著（p＞0.05）。當(dāng)火龍果果皮多糖質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL時，火龍果果皮多糖對ABTS自由基的清除率可達到99.10%。

3.4.2 火龍果果皮對菜籽油的抗氧化性能

油脂氧化反應(yīng)所生成的過氧化物，是油脂氧化酸敗的關(guān)鍵產(chǎn)物。因此，測定油脂POV值，可判定其氧化變質(zhì)的程度。當(dāng)過氧化值明顯升高時，表明油脂的氧化穩(wěn)定性下降，酸敗即將開始。

火龍果果皮多糖的菜籽油抗氧化作用見圖8。

由圖8可知，火龍果果皮多糖對菜籽油的抗氧化作用隨著多糖質(zhì)量濃度的增加而逐漸增強（p<0.05）。當(dāng)質(zhì)量濃度超過為5.0 mg/L時，火龍果皮多糖與等質(zhì)量濃度BHT的菜籽油抗氧化作用相當(dāng)。

圖8 火龍果果皮多糖的菜籽油抗氧化作用

4 結(jié)論

研究了料液比、超聲功率和超聲時間對火龍果果皮多糖提取率的影響，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化了火龍果果皮多糖的超聲輔助提取工藝條件。結(jié)果表明，料液比、超聲功率和超聲時間對火龍果果皮多糖提取有顯著影響。得到超聲輔助法提取火龍果果皮多糖的最佳工藝條件為料液比1∶8，超聲功率101 W，超聲時間26 min，在此條件下，火龍果果皮多糖提取率為13.88%，火龍果果皮多糖能有效清除ABTS自由基，對菜籽油也具有顯著抗氧化作用。

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