甲基苯丙胺對大鼠海馬組織骨架肌動蛋白表達(dá)的影響

陳曉雷，狄蓮，楊秀麗，李新新

（沈陽醫(yī)學(xué)院法醫(yī)司法鑒定所，遼寧 沈陽 110034）

中小劑量的甲基苯丙胺（MA）能夠提高人的心境，使服用者清醒、精神振奮、機(jī)敏、興致勃勃、思維活躍、情緒高漲、注意力集中、工作能力提高，而且可消除疼痛感、疲勞感、饑餓感。長期應(yīng)用會出現(xiàn)軀體和精神依賴，導(dǎo)致其行為異常，甚至?xí)绊懟颊叩囊簧?］。有研究報(bào)道MA依賴者其神經(jīng)元骨架肌動蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變［2］。本研究擬從影響神經(jīng)元形態(tài)和功能的骨架肌動蛋白入手，研究MA依賴大鼠海馬組織的肌動蛋白表達(dá)水平的變化，探討MA類藥物成癮的分子生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 選取健康雄性Wistar大鼠60只，體重（200±18）g，由沈陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究中心提供，許可證號：SCXK（遼）2012－0001。將大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，其中實(shí)驗(yàn)組給予不同劑量的MA分別制作1周、2周、4周依賴模型組，每組10只；對照組分為相應(yīng)的3組，并給予相同劑量的生理鹽水。所有大鼠按分組分籠喂養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水。

1.2 方法

1.2.1 給藥方式 MA依賴1周組采用遞增方式腹腔注射MA（美國Able Laboratories公司），MA遞增劑量為0.5、1、2、8、10、15、20 mg/kg，依次逐日遞增，每天給藥2次（8：00、20：00），相應(yīng)對照組大鼠每日腹腔注射同體積的生理鹽水；染毒1周組進(jìn)行造模評估后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。MA依賴2周組和4周組則按20 mg/（kg·d）繼續(xù)給藥1周和3周，各對照組在相應(yīng)的給藥周期給予相同劑量的生理鹽水［3］，進(jìn)行造模評估后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 造模評估指標(biāo) 大鼠刻板行為評分參照GHF-Dodd方法［4］進(jìn)行評價。腹腔注射MA后每10 min評分一次。評分標(biāo)準(zhǔn)：0分，靜止不動或幾乎沒有活動；1分，正?；顒樱紶栍邢蚯斑\(yùn)動；2分，活動伴隨反復(fù)向前探索；3分，繼續(xù)向前探索；4分，重復(fù)抬頭、搖頭或旋轉(zhuǎn)；5分，迅速搖頭，旋轉(zhuǎn)或搖頭的背腹運(yùn)動。以刻板行為評分≥2分以及刻板行為持續(xù)時間≥15 min，為造模成功。

1.2.3 提取蛋白及測定 將所有大鼠于最后一次給藥5 h后斷頭處死，參照大鼠腦立體定位圖譜對腦組織海馬區(qū)進(jìn)行分離［5］，并將腦組織置于液態(tài)氮中冷凍，于-80℃的條件下保存?zhèn)溆谩⒋笫竽X組織置于磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行勻漿并提取所需蛋白。按常規(guī)提取D單體肌動蛋白（G-actin）、結(jié)合在微絲中的肌動蛋白（F-actin）和pcofilin。采用BradFord法進(jìn)行蛋白濃度測定［6］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 G-actin表達(dá)比較 MA依賴1周、2周組和4周組的G-actin表達(dá)量與相應(yīng)的對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 2組G-actin表達(dá)量比較（n=10，）

表1 2組G-actin表達(dá)量比較（n=10，）

組別實(shí)驗(yàn)組對照組t P 1周組99.7±5.3 100.3±4.8 3.565 0.066 2周組98.5±5.6 98.6±5.4 3.872 0.056 4周組97.6±4.5 98.5±4.7 3.468 0.055

2.2 F-actin表達(dá)比較 MA依賴1周組和2周組的F-actin表達(dá)量與相應(yīng)對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），MA依賴4周組的F-actin表達(dá)量顯著高于相應(yīng)對照組（P＜0.05），見表2。

表2 2組F-actin表達(dá)量比較（n=10，）

4周組202.6±9.4 123.5±8.3 7.352 0.026組別實(shí)驗(yàn)組對照組t P 1周組103.5±3.8 104.2±3.9 3.685 0.062 2周組110.5±4.6 109.8±3.5 3.868 0.058

2.3 p-cofilin表達(dá)比較 MA依賴1周組的pcofilin表達(dá)量與相應(yīng)對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），MA依賴2周組和4周組的p-cofilin表達(dá)量均顯著高于相應(yīng)對照組（P＜0.05），見表3。

表3 2組p-cofilin表達(dá)量比較（n=10，）

表3 2組p-cofilin表達(dá)量比較（n=10，）

組別實(shí)驗(yàn)組對照組t P 1周組109.6±6.8 108.9±4.5 3.736 0.060 2周組108.3±12.4 74.6±5.7 5.368 0.036 4周組116.2±9.2 73.4±6.8 6.352 0.030

3 討論

MA的依賴能夠?qū)е聶C(jī)體的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生可塑性改變，會導(dǎo)致用藥者出現(xiàn)身體和精神上的依賴。已有研究證實(shí)，這種依賴主要通過神經(jīng)細(xì)胞骨架肌動蛋白的重構(gòu)來實(shí)現(xiàn)的。而蛋白的重構(gòu)直接體現(xiàn)在腦區(qū)的G-actin、F-actin和p-cofilin等蛋白含量的變化［7］。因此通過動物實(shí)驗(yàn)對MA對神經(jīng)細(xì)胞骨架肌動蛋白重構(gòu)的影響進(jìn)行研究，對MA的臨床應(yīng)用及禁毒的研究均具有重要的價值［8］。

本研究以MA依賴1周、2周和4周的大鼠和對照組大鼠為研究對象，分別檢測其海馬區(qū)的G-actin、F-actin和p-cofilin等蛋白表達(dá)量，并按照染毒時間和相應(yīng)的對照組進(jìn)行比較，從而證實(shí)MA對大鼠神經(jīng)細(xì)胞骨架肌動蛋白重構(gòu)的影響。研究結(jié)果顯示，MA依賴1周組的G-actin、F-actin和p-cofilin表達(dá)量與對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；MA依賴2周組的G-actin、F-actin表達(dá)量與相應(yīng)的對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而p-cofilin表達(dá)量存在顯著差異；MA依賴4周組的F-actin、p-cofilin表達(dá)量均顯著高于對照組（P＜0.05），證實(shí)了MA對大鼠神經(jīng)細(xì)胞骨架肌動蛋白重構(gòu)的影響。本研究雖然為動物實(shí)驗(yàn)，與MA對人體神經(jīng)細(xì)胞骨架肌動蛋白的重構(gòu)存在一定的差異，但仍具有一定的參考價值。

綜上所述，MA對大鼠神經(jīng)細(xì)胞骨架肌動蛋白的重構(gòu)具有影響，對藥物的臨床應(yīng)用和研究具有參考價值。

［1］鄭志軍，李景業(yè)，韓松，等.不同依賴時間對甲基苯丙胺依賴者空間認(rèn)知功能的影響［J］.中華行為醫(yī)學(xué)與腦科學(xué)雜志，2014，23（8）：707-709.

［2］于亮.嗎啡對大鼠神經(jīng)細(xì)胞骨架肌動蛋白重構(gòu)的影響及其機(jī)制探討［D］.石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2010.

［3］陳曉雷，楊秀麗，王俊平，等.擬人參皂苷F11對甲基苯丙胺依賴大鼠的血清及腦組織中氧化物的影響［J］.華西藥學(xué)雜志，2016，31（2）：152-153.

［4］ Sams-Dodd F.Phencyclidine-induced stereotyped behaviour and social isolation in rats：a possible animal model of schizophrenia［J］.Behav Pharmacol，1996，7（1）：3-23.

［5］諸葛啟釧，葉盛，蘇志鵬，等.大鼠腦立體定位圖譜［M］.3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：64-135.

［6］Qian X，Dong H，Hu X，et al.Analysis of the interferences in quantitation of a site-specifically PEGylated exendin-4 analog by the Bradford method［J］.Anal Biochem，2014，465：50-52.

［7］ Toda S，Shen HW，Peters J，et al.Cocaine increases actin cycling： effects in the reinstatement model of drug seeking［J］.J Neurosci，2006，26（5）：1579-1587.

［8］閆彩珍，于亮，劉川，等.嗎啡依賴大鼠不同腦區(qū)肌動蛋白及其結(jié)合蛋白的表達(dá)變化［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2011，27（8）：1143-1147.