磷尾礦土壤中解磷細(xì)菌的篩選及解磷能力的測(cè)定

陳佳興 秦琴 邱樹毅 王雪酈，3

（1. 貴州省貴州大學(xué)發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550025；2. 貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；3.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025）

中國(guó)是一個(gè)磷礦資源豐富的大國(guó)，據(jù)2013-2014年美國(guó)地質(zhì)調(diào)查局研究數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)現(xiàn)有磷礦儲(chǔ)量約37億t，占全球儲(chǔ)量的5.5%，位居全球第二［1-2］。中國(guó)磷礦資源雖豐富但分布極為不均，主要集中在云南、四川、貴州、湖北等地區(qū)［3］。除分布不均外，中國(guó)磷礦還具有富礦少、貧礦多等不足，全國(guó)磷礦平均品位在17%左右［4-6］。貴州磷礦多以無機(jī)磷鹽形式存在，全省磷礦平均品位為22.14%，磷礦質(zhì)量居全國(guó)之首，以此資源為依托已建立了全國(guó)最重要的磷礦石和磷化工基地［7-9］。然而，磷礦在實(shí)際生產(chǎn)中經(jīng)化學(xué)浮選工藝后將產(chǎn)生大量的磷尾礦渣，其組分特征為w（P2O5）≤10%［10］，因含磷量低，屬工業(yè)固體廢棄物。目前采用丟棄或庫(kù)存的方式處理，給環(huán)境造成一定影響，因此磷尾礦的綜合再利用備受企業(yè)和學(xué)者的關(guān)注?，F(xiàn)階段，我國(guó)磷尾礦的綜合利用率僅有7%，利用途徑包括直接施用于土壤中、利用化學(xué)浮選法或磁選法提取有用礦物、利用酸解法制備化學(xué)復(fù)合肥及制備建筑材料［11-14］。其中，通過酸解法制備的磷肥復(fù)合肥［15］，在使用中不僅降低了植物的吸收利用率［16］，還會(huì)導(dǎo)致土壤出現(xiàn)板結(jié)等現(xiàn)象。因此，探索一種更環(huán)保、更高效的磷尾礦綜合利用途徑具有非常重要的意義。

近年來，隨著應(yīng)用生物技術(shù)的發(fā)展，大量解磷微生物涌現(xiàn)出來。解磷微生物是一類能將難溶性磷酸鹽轉(zhuǎn)化為可溶性磷酸鹽的微生物。目前已知的具有解磷能力的微生物包括細(xì)菌、真菌和放線菌等，其中解磷細(xì)菌的數(shù)量和種類較多。國(guó)內(nèi)外報(bào)道的解無機(jī)磷細(xì)菌主要有產(chǎn)堿菌屬（Alcaligenes）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、歐文氏菌屬（Erwinia）、沙門氏菌屬（Salmonella）、沙雷氏菌屬（Serratia）、多硫桿菌屬（Thiobacillus）等［17-20］。鐘傳青和 Gadd等［21-22］就解磷細(xì)菌的解磷機(jī)制進(jìn)行探索，研究發(fā)現(xiàn)解磷細(xì)菌能分泌磷酸酶和某些低分子量的有機(jī)酸，后者可向環(huán)境中提供質(zhì)子和有機(jī)酸陰離子，從而促使難溶性的磷酸鹽溶解［22］。故可利用解磷微生物制備解磷菌肥，此肥料不僅可提高土壤中磷的利用率，還可減少化學(xué)磷肥的使用量［23］?，F(xiàn)階段，解磷微生物在實(shí)際生產(chǎn)中已有應(yīng)用，但其多樣性不高，因此篩選出具有高效解磷性能的微生物，仍然是生產(chǎn)解磷菌肥的一項(xiàng)重要工作［24-26］。

本研究從貴州甕福磷尾礦堆積場(chǎng)采集的土壤樣品中篩選出高效解磷微生物，并通過菌株形態(tài)特征、生理生化和16S rDNA基因序列分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹對(duì)其菌株進(jìn)行鑒定，并探索其對(duì)難溶性磷酸鹽的解磷能力，為今后開發(fā)和利用解磷菌肥提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 101-1AB電熱恒溫干燥箱：天津泰斯特儀器有限公司；YXQ-LS-75G立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BMJ-250C培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備；JJ-CJ-IFD型超凈工作臺(tái)：蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司；正置熒光顯微鏡：奧林巴斯Olympus；FA-2004N電子分析天平：上海菁海儀器有限公司；Heraeus Multifuge X3R大容量冷凍離心機(jī)：美國(guó)Thermo Fisher公司；721可見分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；PHS-3C型精密酸度計(jì)：上海大普儀器有限公司；PCR 擴(kuò)增儀：德國(guó) Jena；核酸電泳儀：德國(guó) Jena。

1.1.2 試劑 細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)BIOMIGA 公司。磷酸三鈣、葡萄糖、氯化鈉和瓊脂等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 樣品來源 磷礦土壤樣品從貴州甕福磷尾礦堆積場(chǎng)采集。

1.1.4 培養(yǎng)基 無機(jī)磷選擇性固體培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g，Ca3（PO4）25.0 g，（NH4）2SO40.5 g，NaCl 0.3g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0-7.5，121℃滅菌20 min。其中以Ca3（PO4）2作為磷源，需與其他藥品分開滅菌后混合。牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：蛋白胨 10.0 g，牛肉膏 3.0 g，氯化鈉 5.0 g，瓊脂 15 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0-7.4，115℃滅菌30 min。上述兩種培養(yǎng)基的配方中去掉瓊脂即可制成液體培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 解磷細(xì)菌的分離篩選及純化 稱取5 g土壤樣品，加入盛有45 mL 無菌生理鹽水的錐形瓶中，制成稀釋度為10-1的土壤懸液，置于30℃的搖床中振蕩30 min。將土壤懸液按10倍梯度制成10-2-10-6，并各取上述梯度的土壤懸液0.2 mL均勻涂布在無機(jī)磷選擇性固體培養(yǎng)基上，每個(gè)稀釋度重復(fù)3 次。將其倒置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-5 d后，用接種環(huán)挑取具有溶磷圈的單菌落在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上進(jìn)行分離及純化。將純化后的菌種分別點(diǎn)接于無機(jī)磷選擇性固體培養(yǎng)基上，在30℃條件下培養(yǎng)4-5 d后觀察溶磷圈產(chǎn)生情況，通過十字交叉法測(cè)量溶磷圈直徑（D）和菌落直徑（d）。根據(jù)是否產(chǎn)生溶磷圈及D/d值的大小來初步確定菌株的溶磷能力，篩選出具有明顯溶磷圈的菌株轉(zhuǎn)接到牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上，置于4℃下保存。

1.2.2 形態(tài)學(xué)鑒定 將篩選得到的解磷細(xì)菌分別點(diǎn)種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，在30℃條件下培養(yǎng)2 d后觀察單菌落形態(tài)特征。

1.2.3 生理生化測(cè)定 參考第八版《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》［27］測(cè)定糖醇發(fā)酵、淀粉降解、明膠液化、甲基紅試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)等生理生化試驗(yàn)，進(jìn)行觀察和記錄。

1.2.4 分子生物學(xué)鑒定 將解磷細(xì)菌接入50 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，置于30℃，180 r/min的搖床中振蕩2 d，然后使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（美國(guó)BIOMIGA公司）提取解磷細(xì)菌DNA。采用細(xì)菌16S rDNA通用上游引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和下游引物1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）對(duì)解磷細(xì)菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增。細(xì)菌PCR擴(kuò)增體系為25 μL：細(xì)菌DNA模板 2 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各 1 μL，ddH2O 8.5 μL。細(xì)菌 PCR 反應(yīng)程序 ：94℃預(yù)變性5 min后，94℃變性1 min，55℃退火1min，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸10 min，4℃保存。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠，1×TAE電泳緩沖液，上樣5 μL，以5 V/cm電壓電泳檢驗(yàn)，在凝膠成像儀系統(tǒng)進(jìn)行觀察，拍照。再將PCR產(chǎn)物送至英淮捷基貿(mào)易有限公司測(cè)序，為保證序列的準(zhǔn)確度，測(cè)序采用雙向測(cè)序。所得測(cè)序結(jié)果輸入美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心NCBI（National Center of Biotechnology Information）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，選取同源性較高的菌株序列作為參照，用MEGA 5.05軟件構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行菌種鑒定。

1.2.5 磷含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參照NY/T 2421-2013《植株全磷含量測(cè)定 鉬銻抗比色法》［28］中磷含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法，以測(cè)得的吸光度為縱坐標(biāo)，磷濃度為橫坐標(biāo)繪制磷標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 解磷細(xì)菌溶磷能力及培養(yǎng)液pH值的測(cè)定［29］將篩選得到的菌株接種于50 mL的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，經(jīng)30℃，180 r/min過夜培養(yǎng)后得到種子液，菌量約為1×108CFU/mL。再按1%的接種量接種到無機(jī)磷選擇性液體培養(yǎng)基中后，置于上述同等條件下培養(yǎng)7 d。以不接菌作為對(duì)照，每株菌設(shè)置3組平行。搖床培養(yǎng)1-7 d過程中每天定時(shí)取樣，一部分樣品用pH計(jì)直接測(cè)定培養(yǎng)液的pH值。另一部分樣品在10 000 r/min條件下離心5 min，上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后用鉬銻抗比色法測(cè)定OD700值，根據(jù)磷含量標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出上清液中磷的含量。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22. 0和Excel 2003進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)和分析，用Origin 8.5軟件作圖，表中數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值。

2 結(jié)果

2.1 解磷細(xì)菌的分離篩選結(jié)果

在無機(jī)磷選擇性固體培養(yǎng)基上分離出4株菌落形態(tài)不同的菌株，分別編號(hào)為PSB1、PSB2、PSB3和PSB4。通過觀察這4株菌的溶磷圈大?。▓D1）發(fā)現(xiàn)，PSB1、PSB3和PSB4具有明顯溶磷圈（表1）。

表1 溶磷圈法測(cè)量菌株的解磷能力

2.2 解磷細(xì)菌的鑒定結(jié)果

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 3株解磷細(xì)菌在30℃恒溫下培養(yǎng)2 d后菌落直徑可達(dá)3-5 mm，單菌落形態(tài)及描述見表2和圖2。

2.2.2 生理生化測(cè)定 對(duì)篩選所得菌株P(guān)SB1、PSB3和PSB4進(jìn)行部分生理生化指標(biāo)測(cè)定，結(jié)果見表3。3株菌在培養(yǎng)條件下均能利用檸檬酸鹽（鈉），并產(chǎn)生H2O2酶，不能產(chǎn)生H2S和賴氨酸脫羧酶。菌株P(guān)SB1僅能利用D-海藻糖、甘露醇和D-麥芽糖作為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)代謝，而菌株P(guān)SB3能利用葡萄糖、蔗糖和甘露醇等多種糖醇，菌株P(guān)SB4不能利用任何一種碳源。

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定 篩選所得3株解磷細(xì)菌的PCR產(chǎn)物擴(kuò)增電泳圖如圖3所示，將PCR產(chǎn)物送至英淮捷基貿(mào)易有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，PSB1、PSB3和PSB4目的片段大小分別為1 409 bp、1 400bp和 1 410 bp。

圖1 解磷細(xì)菌的溶磷圈圖

表2 三株解磷細(xì)菌菌落的形態(tài)描述

圖2 解磷細(xì)菌單菌落圖

將測(cè)序得到的3株解磷細(xì)菌16S rDNA基因序列輸入NCBI BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)中與較為相似且已發(fā)表的菌株16S rDNA基因序列進(jìn)行比對(duì)，再通過MEGA 5.0軟件，將3株解磷細(xì)菌與其同屬親緣關(guān)系較近的模式菌株進(jìn)行同源性分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖4所示。PSB1與普城沙雷氏菌（Serratia plymuthica）菌株聚在同一分支，其序列同源性為99%；PSB3與嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）菌株聚在同一分支，其序列同源性為99%；PSB4與泡囊短波單胞菌（Brevundimonas vesicularis）菌株聚在同一分支，其序列同源性為99%。

表3 三株解磷細(xì)菌的生理生化特征

圖3 三株解磷細(xì)菌的PCR產(chǎn)物擴(kuò)增圖

結(jié)合菌落形態(tài)特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析結(jié)果，最后鑒定菌株P(guān)SB1、PSB3和PSB4分別為普城沙雷氏菌、嗜麥芽窄食單胞菌和泡囊短波單胞菌。

圖4 三株解磷細(xì)菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 磷含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖5可知，磷含量標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y =0.500 4x-0.007 3，相關(guān)系數(shù)R2為 0.999 3。結(jié)果表明，兩者線性相關(guān)良好。

圖5 磷含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 解磷細(xì)菌解磷能力及培養(yǎng)液pH值的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)利用磷酸三鈣為唯一磷源，對(duì)其進(jìn)行液態(tài)培養(yǎng)，采用鉬銻抗比色法測(cè)定了不同解磷細(xì)菌的解磷能力，結(jié)果見圖6和圖7。

如圖6所示，3株解磷細(xì)菌在7 d液態(tài)培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液的pH值發(fā)生了明顯變化。在起初的24 h內(nèi)，菌株P(guān)SB1、PSB3和PSB4培養(yǎng)液的pH值均顯著下降，由最初pH值7.00分別下降至4.47、4.51和4.99。這可能由于解磷細(xì)菌在生長(zhǎng)代謝過程中產(chǎn)生了各種有機(jī)酸，如蘋果酸、檸檬酸等，導(dǎo)致培養(yǎng)液的pH值降低。直至培養(yǎng)到96 h時(shí)，菌株P(guān)SB3和PSB4培養(yǎng)液中的pH值降至最低，分別為4.30和4.35。菌株P(guān)SB1培養(yǎng)液在144 h時(shí)pH值降至最低，pH值為4.24。在三者pH值分別降至最低后，培養(yǎng)液pH值隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)變化趨勢(shì)并不明顯。

圖6 解磷細(xì)菌液態(tài)培養(yǎng)中pH值的變化

圖7 解磷細(xì)菌液態(tài)培養(yǎng)中溶磷量的變化

如圖7所示，3株解磷細(xì)菌在7 d液態(tài)培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液內(nèi)可溶性磷含量總體呈先增加，后逐漸平緩減少的變化趨勢(shì)。3株解磷細(xì)菌培養(yǎng)液中可溶性磷含量在0-48 h內(nèi)變化顯著，分別迅速升高至 127.82 μg/mL、147.73 μg/mL 和 130.03 μg/mL。菌株P(guān)SB3培養(yǎng)液中可溶性磷含量在72 h時(shí)達(dá)到最高，為153.84 μg/mL，此后可溶性磷含量趨于穩(wěn)定，但從96 h之后，該值出現(xiàn)緩慢降低的趨勢(shì)。同樣，菌株P(guān)SB1和PSB4培養(yǎng)液中可溶性磷含量在96 h時(shí)達(dá)到最高，分別為 148.87 μg/mL 和 146.76 μg/mL，此后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，可溶性磷含量均有所下降，其中菌株P(guān)SB4培養(yǎng)液中可溶性磷含量下降較為明顯。由于解磷細(xì)菌在產(chǎn)生各種有機(jī)酸將磷酸三鈣溶解成可溶性磷的同時(shí)，菌體為維持自身生長(zhǎng)代謝的需求將可溶性磷作為磷源將其利用，從而導(dǎo)致培養(yǎng)液中可溶性磷含量的降低。

3 討論

目前，許多研究者已分離出多種具有解磷能力的細(xì)菌。李白等［30］從土壤中分離得到3株解磷細(xì)菌，其中解磷能力最高可達(dá)到96.31 μg/mL。萬(wàn)兵兵等［31］從鄭州市砂質(zhì)潮土中分離出一株短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus），最高解磷能力可達(dá)到128.90 μg/mL。余旋［32］對(duì)從四川核桃主產(chǎn)區(qū)根際篩選出的解磷細(xì)菌進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)，最優(yōu)解磷能力在200 μg/mL左右。與國(guó)內(nèi)已報(bào)到的文獻(xiàn)相比，該實(shí)驗(yàn)篩選所得的3株細(xì)菌PSB1、PSB3和PSB4的解磷能力均在150 μg/mL左右，都是具有較高解磷能力的菌種。

菌種PSB3被鑒定為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia），目前對(duì)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的研究多以其耐藥性和對(duì)動(dòng)植物感染與致病等方面為主［33-35］，在解無機(jī)磷方面鮮見報(bào)道。但通過該實(shí)驗(yàn)可知，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的解磷效果理想，故今后可對(duì)其在提高磷尾礦中磷的利用率以及研發(fā)解磷菌肥等方面進(jìn)行深入研究。

為了研究實(shí)驗(yàn)篩選所得3株解磷細(xì)菌的解磷能力，對(duì)其進(jìn)行液態(tài)培養(yǎng)。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在液態(tài)培養(yǎng)初期，培養(yǎng)液中可溶性磷含量均隨著培養(yǎng)液pH值的降低而逐漸增加。但當(dāng)培養(yǎng)液的pH值降至最低時(shí)，3株解磷細(xì)菌的解磷能力并非均達(dá)到最大值。通過SPSS 22.0軟件對(duì)3株解磷細(xì)菌培養(yǎng)液的pH值和其解磷能力做相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)SB1和PSB4培養(yǎng)液中pH值與其解磷能力存在顯著的負(fù)相關(guān)性（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)r分別為-0.897和-0.958。說明菌株P(guān)SB1和PSB4是通過分泌某些有機(jī)酸來溶解無機(jī)磷，導(dǎo)致培養(yǎng)液中pH值的降低，該結(jié)論與多數(shù)已報(bào)道的研究結(jié)論相一致［36-38］。而菌株P(guān)SB3培養(yǎng)液中pH值與其解磷能力不存在顯著相關(guān)性（P＞0.05），相關(guān)系數(shù)r為-0.675，表明菌株P(guān)SB3在液態(tài)培養(yǎng)過程中可能產(chǎn)生了除有機(jī)酸以外的非有機(jī)酸物質(zhì)，促使無機(jī)磷溶解。Illmer等［39］研究發(fā)現(xiàn)黃灰青霉（Penicillium aurantiogriseum）和假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）PI1889只有在NH4+介質(zhì)存在條件下才具有溶解無機(jī)磷酸鹽的能力，主要是因?yàn)楹粑饔没騈H4+同化作用釋放出質(zhì)子引起磷酸鹽的溶解，該項(xiàng)研究驗(yàn)證了非生成有機(jī)酸溶解難溶性磷酸鹽的機(jī)理。故菌株P(guān)SB3同樣可能也存在非分泌有機(jī)酸的其他解磷機(jī)理，具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究選取貴州甕福磷尾礦土壤為樣品，成功分離篩選出3株高效解磷細(xì)菌PSB1、PSB3和PSB4。通過對(duì)菌株的形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征及分子生物學(xué)等技術(shù)和理論，初步鑒定菌株P(guān)SB1、PSB3和PSB4分別為普城沙雷氏菌、嗜麥芽窄食單胞菌和泡囊短波單胞菌。將上述菌種置于以磷酸三鈣為唯一磷源的無機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，在30℃恒溫條件下培養(yǎng)7 d，測(cè)得最大解磷能力分別為148.87、153.84和146.76 μg/mL。菌株P(guān)SB1和PSB4培養(yǎng)液中pH值與其解磷能力存在顯著的負(fù)相關(guān)性，而菌株P(guān)SB3不存在，其解磷機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

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