譚文鵬，李文杰，黃兆琦

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院心內(nèi)科， 廣東 廣州 510150)

高血壓是發(fā)病率極高的心血管疾病，可以誘導(dǎo)心肌纖維化和細(xì)胞凋亡等心肌重構(gòu)表現(xiàn)，最終導(dǎo)致心力衰竭。微小核糖核酸(microRNA，miRNA,miR)通過與目標(biāo)基因的信使RNA結(jié)合，調(diào)控其翻譯水平從而影響目標(biāo)蛋白的表達(dá)[1-3]。miRNAs在心肌重構(gòu)、增殖和分化等過程中具有重要的調(diào)控作用[4-5]。miR-133a是心肌組織中含量最豐富的miRNA之一，密切參與心肌肥厚和細(xì)胞凋亡等病理生理過程[6-7]。在心肌梗死患者及動物模型中，心肌組織中miR-133表達(dá)水平均明顯降低[8-9]。近期研究顯示，miR-133a有望成為心血管疾病新的治療靶點(diǎn)[6, 10]。本文通過上調(diào)心肌組織中miR-133a表達(dá)水平，觀察其對自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats, SHR)心肌纖維化的影響。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動物和試劑

14周齡的雄性SHR隨機(jī)分為SHR組、空白病毒轉(zhuǎn)染(SHR+AAV)組和miR-133a過表達(dá)(SHR+miR-133a-AAV)組，每組8只,另取8只14周齡的雄性Wiskar-Kyoto(WKY)大鼠設(shè)為正常對照(WKY)組。大鼠體質(zhì)量220～240 g，購自北京維通利華生物公司，許可證編號為SCXK(京)2013-0009，清潔環(huán)境喂養(yǎng)。采用心臟親和性高的9型腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus-9,AAV-9)作為載體。AAV和miR-133a-AAV 由深圳百恩維公司合成?？罐D(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)小鼠單克隆抗體(MAB240，R&D)；抗結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)兔多克隆抗體(ab6992，Abcam)；抗β-actin抗體(Jackson，稀釋度1∶1 000)；TRIzol試劑(Invitrogen)；miScript Reverse Transcription Kit、miR-133a引物和內(nèi)參照U6引物(QIAGEN)。

2 方法

2.1攜帶miR-133a的腺相關(guān)病毒構(gòu)建 首先構(gòu)建中間載體質(zhì)粒pGenesil-12-pre-miR-133a,限制性酶切位點(diǎn)后的片段中包含了啟動子及目的基因miR-133a的2個(gè)臂，即miR-133a-5’和miR-133a-3’；然后構(gòu)建腺相關(guān)病毒質(zhì)粒pAAV-pre-miR-133a，包含轉(zhuǎn)錄終止信號和哺乳動物細(xì)胞高水平基因表達(dá)的相關(guān)元件。將質(zhì)粒導(dǎo)入AAV-293細(xì)胞，產(chǎn)生含目的基因miR-133a的腺相關(guān)病毒，滴度1×1011TU/L。

2.2大鼠血壓測量 在大鼠安靜清醒狀態(tài)下用無創(chuàng)測壓法測定大鼠尾動脈壓。恒溫系統(tǒng)加熱至39 ℃，使尾動脈出現(xiàn)明顯的搏動波，尾袖氣囊充氣，阻斷尾動脈搏動波，緩慢放氣測量血壓，反復(fù)測量3次。

2.3miR-133a-AAV轉(zhuǎn)染大鼠心肌 大鼠腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，仰臥位固定。暴露氣管，橫向剪開氣管2～3 mm，插管連接小型動物呼吸機(jī)行呼吸支持，設(shè)定呼吸頻率70次/min，潮氣量10～12 mL，呼吸比1∶1。開胸后暴露心臟,采用冠脈灌注法轉(zhuǎn)導(dǎo)病毒載體：miR-133a-AAV組大鼠左心室腔內(nèi)注射0.1 mL miR-133a-AAV，空白病毒組注射0.1 mL AAV。注射病毒液的同時(shí)用血管鉗夾閉主動脈10 s，使病毒液不能進(jìn)入體循環(huán)而泵入冠狀動脈。關(guān)胸后撤除呼吸機(jī)，縫合頸部皮膚。

2.4大鼠心肌組織Masson染色及觀察 4組大鼠均在轉(zhuǎn)染4周后(18周齡時(shí))取心臟標(biāo)本。心肌組織石蠟切片行Masson膠原染色，光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織膠原改變。測量心肌膠原容積分?jǐn)?shù)[collagen volume fraction,CVF，CVF(%)=心肌膠原面積∕所測視野面積×100%]及血管周圍膠原面積與管腔面積比率(perivascular collagen area to lurninal area ratio，PVCA/LA=小動脈周圍膠原面積∕小動脈管腔面積)。

2.5免疫組織化學(xué)染色 切片脫蠟后抗原熱修復(fù)，消除內(nèi)源性過氧化物酶，分別加入小鼠抗大鼠TGF-β1單克隆抗體(1∶50)和兔抗大鼠CTGF兔多克隆抗體(1∶800)，4 ℃孵育過夜；相應(yīng) II 抗室溫孵育2 h；ABC工作液孵育后DAB法顯色。光學(xué)顯微鏡下觀察，棕色顆粒為陽性。

2.6Western blot檢測 提取心肌組織總蛋白，測定蛋白濃度；行10% SDS-PAGE 分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜；封閉1 h，加入抗TGF-β1小鼠單克隆抗體(1∶10 000)和CTGF兔多克隆抗體(1∶5 000)，4 ℃孵育過夜；加入羊抗鼠II抗(1∶2 000)和羊抗兔 II 抗(1∶5 000)室溫孵育1 h；顯色顯影定影，掃描膠片，用圖像分析軟件進(jìn)行灰度分析。

2.7Real-time PCR 提取大鼠心肌總RNA；逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為miScript HiFlex Buffer 2 μL、Nucleics Mix 1 μL、miScript Reverse Trans-criptase Mix 1 μL和總RNA 6 μL。miR-133a的上游引物序列為5’-GCCAAGCTGGTAAAATGGAA-3’，下游引物序列為5’-TATGGTTTTGACGACTGTGTGAT-3’，內(nèi)參照U6的上游引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列為5’-AACGCTTCACGAATTTGCG-3’。PCR反應(yīng)體系為cDNA 1 μL、miScript Universal Primer 1 μL、miR-133a引物或U6引物各1 μL、SYBR Green qPCR Mix 10 μL和水7 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)完成后，在實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中調(diào)整基線和閾值，達(dá)到閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)為各反應(yīng)孔的Ct值。目的基因相對量用2-ΔΔCt法計(jì)算。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。檢測結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠的一般情況

與對照組比較，SHR組、SHR+AAV組和SHR+miR-133a-AAV組大鼠的尾動脈收縮壓(systolic blood pressure,SBP)和舒張壓(diastolic blood pressure,DBP)均明顯升高,見表1。

表1 各組大鼠尾動脈壓與心肌膠原含量的變化Table 1. Comparison of tail artery pressure and collagen in myocardial tissues of the rats (Mean±SD. n=8)

*P<0.05vsWKY group;#P<0.05vsSHR group.

2 大鼠心肌組織中miR-133a的表達(dá)

SHR組大鼠心肌組織中miR-133a表達(dá)水平明顯低于對照組；冠脈灌注miR-133a-AAV至大鼠心臟，4周后檢測心肌組織中miR-133a的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-133a表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),見圖1。

Figure 1. The expression of miR-133a in the myocardial tissues of rats. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsWKY group;#P<0.05vsSHR group.

圖1各組大鼠心肌組織中miR-133a的表達(dá)

3 大鼠心肌組織Masson染色結(jié)果

與對照組相比，SHR組大鼠心肌細(xì)胞間隙增寬，可見大量藍(lán)色膠原纖維沉積，出現(xiàn)明顯的心肌纖維化，CVF和PVCA/LA明顯升高(P<0.05);與SHR組相比，SHR+miR-133a-AAV組大鼠心肌細(xì)胞膠原沉積明顯減少，心肌纖維化程度降低，CVF和PVCA/LA明顯降低(P<0.05),見圖2、表1。

4 大鼠心肌組織TGF-β1和CTGF蛋白表達(dá)的變化

免疫組化檢測顯示，TGF-β1主要在成纖維細(xì)胞中表達(dá)，分布在細(xì)胞膜、細(xì)胞漿及細(xì)胞間隙，CTGF表達(dá)在成纖維細(xì)胞及心肌細(xì)胞，主要分布在胞漿。對照組心肌組織中有少量TGF-β1和CTGF表達(dá)，SHR組心肌組織中可見TGF-β1和CTGF大量表達(dá)，SHR+miR-133a-AAV組心肌TGF-β1和CTGF表達(dá)減少，見圖3、4。Western blot定量檢測顯示，SHR組心肌組織中TGF-β1和CTGF蛋白表達(dá)水平顯著高于對照組，SHR+miR-133a-AAV組心肌組織中TGF-β1和CTGF蛋白表達(dá)水平明顯低于SHR組(P<0.05),見圖5。

Figure 2. Masson staining of the myocardial tissues of the rats (×400).

圖2大鼠心肌組織Masson染色結(jié)果

Figure 3. The immunohistochemical staining for TGF-β1 in the myocardial tissues of the rats (×400).

圖3大鼠心肌組織中TGF-β1免疫組化結(jié)果

Figure 4. The immunohistochemical staining for CTGF in the myocardial tissues of the rats (×400).

圖4大鼠心肌組織中CTGF免疫組化結(jié)果

Figure 5. The protein levels of TGF-β1 and CTGF in the myocardial tissue of the rats. Mean±SD.n=12.*P<0.05vsWKY group;#P<0.05vsSHR group.

圖5各組大鼠心肌組織中TGF-β1和CTGF蛋白水平的變化

討 論

miR-133a是肌肉特異性miRNA，在心肌組織中表達(dá)豐富。在心肌梗死患者和動物模型中，心肌miR-133a表達(dá)水平出現(xiàn)明顯降低，并影響心肌收縮力[8-9]。研究顯示，miR-133a基因敲除小鼠的心臟發(fā)生嚴(yán)重的心肌纖維化，并最終因心力衰竭死亡，表明miR-133a在心肌細(xì)胞間質(zhì)合成平衡中具有關(guān)鍵作用[11]。高血壓可導(dǎo)致心肌細(xì)胞外間質(zhì)膠原沉積，引起心臟結(jié)構(gòu)和功能異常。研究發(fā)現(xiàn)，在自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織中miR-133a的表達(dá)水平顯著降低，伴隨明顯的膠原沉積[12],說明miR-133a可能參與高血壓心肌纖維化的進(jìn)程。

TGF-β1和CTGF是非常重要的促纖維化的細(xì)胞因子[13]。TGF-β1是調(diào)節(jié)細(xì)胞外間質(zhì)代謝和啟動纖維化的關(guān)鍵因子[14]；CTGF是TGF-β1促纖維化作用通路的重要下游因子，并維持纖維化進(jìn)展[15]。TGF-β1在成纖維細(xì)胞及心肌細(xì)胞都能誘導(dǎo)產(chǎn)生CTGF。TGF-β1通過Smad信號通路以及細(xì)胞激酶C和Ras/MEK/ERK信號途徑誘導(dǎo)CTGF合成，共同形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)，在尼古丁刺激下的心房成纖維細(xì)胞中，miR-133a表達(dá)水平下調(diào)并導(dǎo)致TGF-β1蛋白水平顯著升高，伴隨大量膠原合成[17]；在SRF基因過表達(dá)的心肌肥厚動物模型中，miR-133a表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致CTGF大量合成[18]。miR-133a與TGF-β1/CTGF有密切關(guān)系，但是miR-133a能否通過TGF-β1/CTGF途徑調(diào)控高血壓心肌纖維化尚不明確。

本研究發(fā)現(xiàn)，SHR的尾動脈壓明顯升高，伴隨心肌細(xì)胞間隙大量膠原纖維沉積，導(dǎo)致心肌纖維化。病理檢測顯示SHR心肌成纖維細(xì)胞及心肌細(xì)胞合成大量TGF-β1及CTGF，蛋白定量檢測也發(fā)現(xiàn)，SHR心肌TGF-β1及CTGF蛋白水平明顯升高；上調(diào)SHR心肌miR-133a表達(dá)水平，抑制了心肌TGF-β1及CTGF蛋白合成，使心肌間隙的膠原沉積減少，心肌纖維化水平顯著降低。

因此，我們推測miR-133a通過抑制TGF-β1及CTGF蛋白表達(dá)，對高血壓心肌纖維化發(fā)揮調(diào)控作用，為高血壓纖維化治療尋找新靶點(diǎn)提供了依據(jù)。

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] Ul Hussain M. Micro-RNAs (miRNAs): genomic organisation, biogenesis and mode of action[J]. Cell Tissue Res, 2012,349(2):405-413.

[2] Lee S, Vasudevan S. Post-transcriptional stimulation of gene expression by microRNAs[J]. Adv Exp Med Biol, 2013,768:97-126.

[3] 何 鈴, 方梅霞, 陳利國, 等. 高血壓病血瘀證相關(guān)miRNA的篩選[J]. 中國病理生理雜志, 2015,31(5):817-822.

[4] Lv D, Liu J, Zhao C, et al. Targeting microRNAs in pathological hypertrophy and cardiac failure[J]. Mini Rev Med Chem, 2015,15(6):475-478.

[5] Tao L, Bei Y, Zhou Y, et al. Non-coding RNAs in cardiac regeneration[J]. Oncotarget, 2015,6(40):42613-42622.

[6] Chen Y, Sun P, Bai W, et al. MiR-133a regarded as a potential biomarker for benzene toxicity through targeting Caspase-9 to inhibit apoptosis induced by benzene metabolite (1,4-Benzoquinone)[J]. Sci Total Environ, 2016, 571: 883-891.

[7] Diniz GP, Lino CA, Guedes EC, et al. Cardiac micro RNA-133 is down-regulated in thyroid hormone-mediated cardiac hypertrophy partially via Type 1 Angiotensin II receptor[J]. Basic Res Cardiol, 2015, 110(5):49.

[8] Bo?tjaniE, Zidar N, GlavaD. MicroRNAs and cardiac sarcoplasmic reticulum calcium ATPase-2 in human myocardial infarction: expression and bioinformatic analysis[J]. BMC Genomics, 2012,13:552.

[9] Dakhlallah D, Zhang J, Yu L, et al. MicroRNA-133a engineered mesenchymal stem cells augment cardiac function and cell survival in the infarct heart[J]. J Cardiovasc Pharmacol, 2015,65(3):241-251.

[10] Liu Y, Liang Y, Zhang JF, et al. MicroRNA-133 mediates cardiac diseases: Mechanisms and clinical implications[J]. Exp Cell Res, 2017, 354(2):65-70.

[11] Liu N, Bezprozvannaya S, Williams AH, et al. micro RNA-133a regulates cardiomyocyte proliferation and suppresses smooth muscle gene expression in the heart[J]. Genes Dev, 2008, 22(23):3242-3254.

[12] 譚文鵬, 楊 侃, 陳晞明, 等. 自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織microRNA-133a與TGF-β1蛋白表達(dá)的改變及意義[J]. 中國病理生理雜志, 2013, 29(4):748-751.

[13] 應(yīng)趙建, 黃曉敏, 余埡妮, 等. PI3K/CTGF信號通路在TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞表達(dá)collagen Ⅰ過程中的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2017, 33(3):489-494.

[14] Liu G, Ma C, Yang H, et al. Transforming growth factor β and its role in heart disease[J]. Exp Ther Med, 2017, 13(5):2123-2128.

[15] Chatzifrangkeskou M, Le Dour C, Wu W, et al. ERK1/2 directly acts on CTGF/CCN2 expression to mediate myocardial fibrosis in cardiomyopathy caused by mutations in the lamin A/C gene[J]. Hum Mol Genet, 2016, 25(11):2220-2233.

[16] Cheng JC, Chang HM, Fang L, et al. TGF-β1 up-regulates connective tissue growth factor expression in human granulosa cells through Smad and ERK1/2 signaling pathways[J]. PLoS One, 2015,10(5):e0126532.

[17] Shan H, Zhang Y, Lu Y, et al. Downregulation of miR-133 and miR-590 contributes to nicotine-induced atrial remodelling in canines[J]. Cardiovasc Res, 2009, 83(3):465-472.

[18] Angelini A, Li Z, Mericskay M, et al. Regulation of connective tissue growth factor and cardiac fibrosis by an SRF/microRNA-133a axis[J]. PLoS One, 2015,10(10):e0139858.