蒲含林, 賴潛, 林順權(quán), 李秀峰, 袁曉
(1.暨南大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院細胞生物學(xué)系,廣東 廣州510632;2.海南制藥廠有限公司,海南 五指山572200;3.廣州牌牌生物科技有限公司,廣東廣州510540)
膽木(Nauclea Officinalis)原為海南民間用藥材,始載于廣州部隊編《常用中草藥手冊》,由《中國藥典》(1977年版1部)[1]收載.前期文獻研究報道膽木的主要活性成分為生物堿類物質(zhì),其莖、莖皮和根均能入藥,性味苦、寒,具有抗菌消炎、清熱解毒、消腫止痛之功效,主要劑型有片劑和肌肉注射劑,臨床用于上呼吸道感染的治療有較好效果[2-4].裸花紫珠Callicarpa nudiflora Hook.ex Arn.是馬鞭草科紫珠屬植物,以干燥葉和枝入藥[5],主要分布于我國的廣東、海南和廣西等省,在海南有大面積人工種植.有抗菌消炎、止血鎮(zhèn)痛等功效[6-7].裸花紫珠以單味藥成藥,主要劑型有膠囊、片劑,臨床主要用于燒、燙傷外用救治和術(shù)后出血內(nèi)服恢復(fù),尤適用于婦科的產(chǎn)后恢復(fù)和炎癥消退[8].裸花紫珠入選《中國藥典》2015年版新增中藥品種,從裸花紫珠中發(fā)現(xiàn)的主要化學(xué)成分類型有苯丙素類、黃酮類、酚酸類、三萜類、二萜類、環(huán)烯醚萜類等[9-10].膽木多糖和裸花紫珠多糖均為最先分離出的水溶性多糖,這里報道其分離純化方法和分子量測定的結(jié)果.
電霧式檢測器(charged aerosol detector,CAD)為新型檢測器,可用于無紫外吸收化合物檢測,與液相色譜分離系統(tǒng)聯(lián)用,其重現(xiàn)性、穩(wěn)定性很好,且靈敏度高,能準確地用于定量分析或半定量分析[11].凝膠滲透色譜 (gel permeation chromatography,GPC)常被應(yīng)用于高聚物的分子量及其分布的測定,有研究用GPC/LALLS儀檢測多糖分子量、分子量分布[12].金鑫等[13]用 GPC測量仙人掌多糖的相對分子量質(zhì)量,本研究首先從膽木的水溶性部位分離出水溶性多糖,采用HPLC/CAD聯(lián)合排阻色譜法測定膽木多糖的分子量和分子量分布,該方法檢測結(jié)果直觀、準確和快速,可以方便地推廣到其他多糖類物質(zhì)分子量的分析和測定.
1.1.1 試劑
超純水,體積分數(shù)為95%藥用酒精,純化水,自制膽木多糖和裸花紫珠多糖,三氟乙酸.
1.1.2 實驗材料
重均分子量(Mw)分別為 10 000、40 000、70 000、110 000、500 000的葡聚糖(山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司);膽木藥材和裸花紫珠藥材(海南制藥廠有限公司).
1.1.3 儀器
Uplc DIONEX UltiMate 3000 RS pump(超高壓液相色譜);Rs Autosampler(雙三元液相色譜泵);Rs Column Compartment(RS柱室);Corona Veo RS Charged Aerosol Detector(Corona Veo RS檢測器);工作站:Chromeleon 7 Extension Pack GPC Templates(變色龍色譜軟件);Thermo DIONEX ICS-5000+SP(戴安離子色譜儀).
1.2.1 色譜條件
色譜柱 Biobasic SEC 300(7.8 mm×300 mm,5μm);流動相:超純水;柱溫:(35±0.5)℃;進樣量:90μL;運行時間:30 min;流速:1.0 mL/min.
1.2.2 膽木多糖制備
取粉碎至10目左右的干燥的膽木藥材200 g,用10、8和6倍體積分數(shù)為95%藥用酒精回流提取3次后晾干酒精;藥材再用10、8和6倍的純化水煮沸提取3次,水提取液合并后減壓濃縮至無酒精味,加入相當于濃縮液體積3倍體積分數(shù)的95%酒精使產(chǎn)生沉淀,離心并收獲沉淀物,用體積分數(shù)為80%酒精溶液洗滌至洗出液無顏色,再用體積分數(shù)為60%酒精溶液洗滌至洗出液無顏色[14-15],再用適量純化水煮沸溶解,過濾棄去不溶物,將濾液用透析袋透析,上G100凝膠柱,水洗脫得到含糖部分,用高效液相凝膠色譜法聯(lián)合CAD檢測器測定分子量分布[16-17].
1.2.3 裸花紫珠多糖的制備
將陰干的裸花紫珠材料用15倍質(zhì)量,體積分數(shù)為95%的乙醇在室溫下浸泡4~6 h后濾出乙醇溶液,同法反復(fù)浸泡提取3~4次,合并醇提液回收乙醇;倒出乙醇提取過的裸花紫珠葉至干凈的臺面上,晾干葉片上的殘余乙醇.用裸花紫珠葉10~20倍質(zhì)量的水煮沸30 min,冷至50~60℃后傾出;同法用水再提取1次,合并水提取液減壓濃縮至溶液體積為100mL左右,得到裸花紫珠葉水提取物.向水提取液中加入水溶液質(zhì)量3~4倍體積分數(shù)為95%的乙醇,有絮狀沉淀物析出,移出沉淀上部的醇溶液,反復(fù)水溶醇沉至醇洗上清液無色為止.將初步純化的裸花紫珠多糖用純化水溶解后放入透析袋中,再將透析袋放入盛純化水的容器內(nèi),透析48 h,將透析液上G-100葡聚糖凝膠柱,水洗脫,收集含糖組分[18-19].
1.3.1 精密度考察
精密稱取重均分子量(Mw)為70 000的葡聚糖對照品適量,配成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL溶液,經(jīng)0.22μm的微孔濾膜過濾.連續(xù)進樣5次,以保留時間和峰面積的變化來考察精密度.
1.3.2 穩(wěn)定性考察
將膽木多糖樣品按1.3.1實驗條件平行操作,每1 h測定1次,測定5次,分別測定其峰面積和保留時間,考察其穩(wěn)定性.
1.4.1 標準品的配制
標準品配制:精密稱取重均分子量Mw分別為 10 000、40 000、70 000、110 000、500 000的5種葡聚糖對照品適量,配成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的標準溶液,經(jīng)0.22μm的微孔濾膜過濾,進樣.
記錄色譜圖,用Chromeleon 7 Extension Pack GPC Templates軟件以標準葡聚糖重均分子量Mw的對數(shù)logMw為y坐標,以保留時間Tr為x坐標對其進行回歸處理,用三次方程y=C3x3+C2x2+C1x+C0進行擬合作為校正曲線.
1.4.2 供試品的配制
供試品溶液的制備:精密稱取膽木多糖和裸花紫珠多糖適量,用60℃熱水溶解,配制質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL供試品溶液,0.22μm的微孔濾膜過濾.
1.4.3 膽木和裸花紫珠多糖分子量和分子量分布測定
供試品溶液按1.2色譜條件進樣,記錄圖譜,得到供試品分子量分布圖及數(shù)均分子量(Mn)、重均分子量(Mw)、Z均分子量(Mz)、Z均分子量(Mz)+1.
2.1.1 精密度考察
經(jīng)5次進樣后,葡聚糖的凝膠色譜峰的保留時間和峰面積如表1所示,保留時間相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)為 0.90%,峰面積RSD為1.83%.可見,精密度良好,儀器連續(xù)進樣誤差較小.
2.1.2 穩(wěn)定性考察
由表2可見,樣品多糖的峰面積和保留時間的RSD分別為0.31%和0.99%,可知儀器穩(wěn)定性良好,試驗誤差較小.
表2 穩(wěn)定性考察結(jié)果Table 2 Stability study results
2.2.1 標準曲線
已知分子量的標樣葡聚糖溶液按上述方法條件測定,獲得重均分子量對數(shù)值LogMw和保留時間Tr(表 3、圖 1).
表3 LogMw和T rTab le 3 LogMw and T r
回歸方程為 logMw=-0.069Tr3+1.539Tr2-11.542Tr+33.940
2.2.2 分子量分布圖
膽木多糖的分子量分布和分子量積分分布見圖2和圖3.
裸花紫珠多糖的分子量分布和分子量積分分布見圖4和圖5.
2.2.3 Mn、Mw、Mz、Mz+1計算結(jié)果
圖1 葡聚糖系列標準品的回歸曲線Fig.1 Glucan standard series of regression curves
計算結(jié)果顯示(圖6、圖7),膽木多糖的重均分子量Mw為2.6×105,分子量分散系數(shù)為1.13,分布帶較窄;裸花紫珠的重均分子量Mw為1.68×105分子量分散系數(shù)為4.45,分布帶較寬.
圖2 膽木多糖分子量分布曲線Fig.2 Polysaccharide molecular weight distribution curve of Nauclea officinalis
圖3 膽木多糖分子量積分分布曲線Fig.3 Polysaccharide molecular weight distribution curve of Nauclea officinalis
圖4 裸花紫珠多糖的分子量分布曲線Fig.4 Polysaccharides molecular weight distribution curve of Callicarpa nudiflora
圖5 裸花紫珠多糖分子量積分分布曲線Fig.5 Polysaccharides molecular weight distribution curve of Callicarpa nudiflora
表4 膽木多糖分子量分布數(shù)據(jù)Table 4 Polysaccharide molecular distribution data of Nauclea officinalis
表5 裸花紫珠多糖分子量分布數(shù)據(jù)Table 5 Polysaccharides molecular weight distribution data of Callicarpa nudiflora
測定大分子物質(zhì)的分子量除了用凝膠柱的高效液相色譜配合不同類型的檢測器以外,還有光散射法和滲透壓法等測定大分子物質(zhì)的分子量和分子量分布的方法,不同方法所測得的分子量及其分布會有不同程度的誤差.本實驗選用HPLC/CAD聯(lián)合凝膠色譜法測定膽木多糖的分子量及其分布,并對此方法進行了精密度和穩(wěn)定性考察,證明該法具有操作簡便、靈敏度高、穩(wěn)定性好、準確性高以及重現(xiàn)性好的特點,另外CAD檢測的原理是把樣品霧化,通過檢測分子的體積大小轉(zhuǎn)換成分子量,與激光光散射儀測定的原理相似[20],誤差較小,數(shù)據(jù)處理簡便,結(jié)果準確可靠.此法所測得的膽木多糖的 Mw為 2.61×105,Mn為 2.30×105,Mz為 2.85×105,Mz+1為 3.02×105,分子量分散系數(shù)為1.13,分布較窄;圖2膽木多糖分子量分布曲線與圖3均能清晰反映高聚物的分布寬度,較好地反應(yīng)了膽木多糖中1種組分的分子量及分子量分布.此法所測得的裸花紫珠多糖的Mw為7.47×105,Mn為 1.68×105,Mz為 5.13×106,Mz+1為1.29×107,分子量分散系數(shù)為 4.45,分布較寬;分子量分布曲線和分子量分布積分曲線顯示軟件自動積分時取值范圍較寬,能夠在一定程度上反應(yīng)所測定的物質(zhì)的分子量和分子量分布,但分布范圍較寬,這可能主要與樣品的質(zhì)量濃度和凝膠柱的柱效有關(guān).
試驗中標準物質(zhì)的選擇也會對測定的結(jié)果有一定的影響,對于多糖中單糖組成的主要部分是葡萄糖的樣品,以葡聚糖作為標準產(chǎn)生的誤差會較小,單糖組成分析實驗證實膽木和裸花紫珠水溶性多糖的主要單糖組成均是葡萄糖.另外利用CAD檢測器的方法對于分析測定初步純化后的多糖中含有幾個多糖組分也非常方便和實用,對紫外無吸收,折光檢測不靈敏的大分子物質(zhì)的分子量和分子量分布測定也有良好的效果.
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