兒童肺炎支原體肺炎肺泡灌洗液中細(xì)胞因子分析

郭偉，張同強(qiáng)，徐勇勝，劉福軍

肺炎支原體肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumoniae，MPP）是常見的兒童社區(qū)獲得性疾病，發(fā)病率逐年增高，發(fā)病年齡呈逐年減小趨勢［1］。盡管MPP大多預(yù)后良好，但部分病例可并發(fā)多器官、多系統(tǒng)損害，對(duì)兒童的生命健康造成很大的危害［2］。在有關(guān)MPP發(fā)病機(jī)制的研究中，細(xì)胞因子激活在肺部炎癥反應(yīng)中的作用受到越來越多的關(guān)注，肺炎支原體感染能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生各種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子通過與細(xì)胞表面受體結(jié)合，介導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫功能及炎癥反應(yīng)［3-4］。本研究以MPP患兒肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中細(xì)胞因子為切入點(diǎn)，旨在探討MPP局部病變的發(fā)病機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 以2017年1月—12月間收入院的90例MPP患兒為研究對(duì)象，年齡1～15歲，性別不限。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合MPP的診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］。（2）胸部影像學(xué)表現(xiàn)為大片狀陰影，占據(jù)1個(gè)或以上肺段范圍。（3）無混合其他感染的依據(jù)，如衣原體、細(xì)菌、病毒等病原體感染。（4）不伴有肺結(jié)核、支氣管哮喘等其他呼吸系統(tǒng)疾病。（5）既往未診斷患有免疫性疾病，無不明原因的長期發(fā)熱、關(guān)節(jié)腫痛。（6）無近期或長期服用糖皮質(zhì)激素史，近2個(gè)月內(nèi)未應(yīng)用免疫球蛋白、干擾素等免疫調(diào)節(jié)劑和免疫抑制劑。所有患兒按病程分為3組，每組30例。分為發(fā)?。? d組（A1組），發(fā)病7～14 d組（A2組），發(fā)病15～30 d組（A3組）。對(duì)照組（B組）為同期因支氣管異物（21例）或者慢性咳嗽（9例）行纖維支氣管鏡檢查的患兒，共30例，無退組現(xiàn)象。各組在年齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 所有研究對(duì)象均取得家屬同意后經(jīng)纖維支氣管鏡進(jìn)行局部肺泡灌洗，并留取BALF，對(duì)照組選擇非病變部位進(jìn)行局部灌洗，留取BALF。所有標(biāo)本經(jīng)離心留取上清液置-20℃冰箱保存待測。

1.2.2 細(xì)胞因子測定 采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測BALF中腫瘤壞死因子（TNF）-α、干擾素（IFN）-γ、白細(xì)胞介素（IL）-2、IL-4、IL-6和IL-10的含量，試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組樣本間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組內(nèi)多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

MPP患兒BALF中IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6和IL-10水平較對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。IFN-γ、IL-2水平在A1組最高，與A2及A3組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。TNF-α分泌高峰在A1組，高于A2及A3組（P＜0.01），A2與A3組相比無明顯變化。IL-4與IL-6水平在A2組高于A1和A3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。IL-10在A1及A2組明顯高于A3組（P＜0.01），而A1組與A2組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

Tab.1 Expression of BALF inflammatory factors in treatment group and control group表1 治療組與對(duì)照組BALF炎癥因子表達(dá)結(jié)果（n=30）

3 討論

肺炎支原體感染后，可促使淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和上皮細(xì)胞產(chǎn)生大量細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)，從而調(diào)節(jié)人體免疫［4，6］。目前國內(nèi)外文獻(xiàn)對(duì)MPP在細(xì)胞因子方面的研究結(jié)論不一，爭議頗多。Oishi等［7］研究證實(shí)，在肺炎支原體感染急性期，血清TNF-α、IL-18明顯升高，恢復(fù)期明顯降低。喬紅梅等［8］研究發(fā)現(xiàn)MPP患兒BALF和血清中IL-6、IL-10、TNF-α水平在發(fā)病的急性期明顯高于對(duì)照組，并且BALF中IL-6、IL-10、TNF-α濃度高于血清中相應(yīng)細(xì)胞因子濃度，血清細(xì)胞因子與BALF中相應(yīng)的細(xì)胞因子有相關(guān)性，提示患兒血清炎癥水平間接反映肺部炎癥情況，最能直接反映肺部炎癥情況的卻是BALF中的細(xì)胞因子水平。另有研究發(fā)現(xiàn)，在難治性MPP中，患兒BALF中細(xì)胞因子IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ較對(duì)照組明顯升高，并且IL-2、IL-8持續(xù)高水平可能與難治性MPP患兒激素治療后持續(xù)發(fā)熱有關(guān)［9］。本研究中MPP組各期細(xì)胞因子較對(duì)照組明顯升高，其中IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-8和IL-10變化與之有類似發(fā)現(xiàn)。Guo等［3］研究證實(shí)在BALF中，T細(xì)胞的激活在急性和嚴(yán)重MPP患兒的炎癥反應(yīng)中期發(fā)揮重要作用，并且IL-6水平與疾病的嚴(yán)重性及預(yù)后有關(guān)?？靛鹊龋?0］研究發(fā)現(xiàn)在嚴(yán)重MPP患兒BALF中IFN-γ、IL-4水平明顯升高，IL-4/IFN-γ比例亦明顯升高。本研究中BALF中IFN-γ、IL-4水平較對(duì)照組明顯升高，提示上述細(xì)胞因子參與MPP疾病的發(fā)病過程，與上述研究相符合。

有研究證實(shí)血清及BALF中TNF-α在MPP急性期明顯升高［8］，并且與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［11］。但急性期中具體何時(shí)分泌高峰少見相關(guān)研究。本研究中TNF-α在病程1周內(nèi)達(dá)到高峰，后逐漸下降，至病程15～30 d仍高于對(duì)照組。陳丹等［12］研究發(fā)現(xiàn)急性期MPP患兒與普通肺炎患兒相比，血清IFN-γ明顯升高；在兒童MPP急性期BALF中亦有相同發(fā)現(xiàn)［9］，與本研究結(jié)果相類似。本研究更進(jìn)一步闡述了BALF中IFN-γ隨病程的變化規(guī)律，為進(jìn)一步了解MPP的發(fā)病機(jī)制提供了依據(jù)。IL-2細(xì)胞水平在不同的研究中結(jié)論不一。有報(bào)道在難治性MPP患兒BALF中IL-2持續(xù)高水平可能與患兒激素治療后持續(xù)發(fā)熱有關(guān)［9］，而史良俊等［13］研究發(fā)現(xiàn)難治性MPP組急性期及恢復(fù)期血清IL-2水平均顯著低于MPP組和對(duì)照組，考慮與病例選擇、標(biāo)本收集、標(biāo)本類型及測量方式不同等有關(guān)。本研究中MPP患兒發(fā)病1個(gè)月內(nèi)BALF中IL-2水平明顯升高，在發(fā)病1周時(shí)分泌達(dá)到高峰，后逐漸下降，提示細(xì)胞IL-2參與MPP發(fā)病過程。細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-2主要由Th1分泌，能增強(qiáng)T細(xì)胞、NK細(xì)胞及B細(xì)胞等的免疫活性，本研究中細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-2均在發(fā)?。? d時(shí)達(dá)到高峰，可間接提示MPP患兒在病程7 d內(nèi)以Th1免疫反應(yīng)為主。

Ye等［14］發(fā)現(xiàn)MPP患兒在急性期血清IL-4、IL-6水平明顯高于恢復(fù)期，并且IL-4水平與疾病嚴(yán)重性有關(guān)，同時(shí)CD4+/CD8+T細(xì)胞比例明顯升高，證明MPP患兒發(fā)病機(jī)制中Th1/Th2細(xì)胞平衡起重要作用。藍(lán)引樂等［9］研究證實(shí)在難治性MPP患兒BALF中IL-4、IL-6和IL-10較對(duì)照組明顯升高，本研究中選取的病例嚴(yán)重程度與上述研究相比相對(duì)較輕，但細(xì)胞因子IL-4、IL-6和IL-10有類似的研究發(fā)現(xiàn)，并且動(dòng)態(tài)研究相關(guān)細(xì)胞因子隨病程的變化規(guī)律，證實(shí)細(xì)胞因子IL-4和IL-6在病程7～14 d達(dá)到高峰。喬紅梅等［8］研究發(fā)現(xiàn)MPP患兒BALF和血清中IL-6及IL-10水平在發(fā)病的急性期明顯高于對(duì)照組，并且BALF中IL-6和IL-10濃度高于血清中相應(yīng)細(xì)胞因子濃度。陳良東等［11］研究發(fā)現(xiàn)MPP患兒病情嚴(yán)重程度與IL-6濃度變化呈正相關(guān)，與T細(xì)胞亞群CD3+、CD3+CD4+細(xì)胞百分率及 CD4+/CD8+變化呈負(fù)相關(guān)。Ding等［4］研究發(fā)現(xiàn)血清細(xì)胞因子IL-10在兒童MPP患兒中明顯升高，而輕度MPP患兒較重癥MPP患兒明顯升高，提示IL-10作為重要的細(xì)胞因子參與MPP的發(fā)病過程，與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)。IL-4、IL-6和IL-10主要由Th2分泌，主要參與體液免疫反應(yīng)，而IL-4和IL-6分泌高峰在病程7～14 d，間接反映該期Th2介導(dǎo)的免疫反應(yīng)可能在MPP的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。

總之，本研究證實(shí)細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6和IL-10參與MPP的發(fā)病機(jī)制，并且動(dòng)態(tài)闡述了分泌水平隨病程的變化規(guī)律，為進(jìn)一步治療MPP提供了理論依據(jù)。

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