范義增，淡煒超,2，白欣姍,2，任加強(qiáng),2，高 歌,2，欒嘉欣,2，賀大林，曾 津

(西安交通大學(xué)：1.第一附屬醫(yī)院泌尿外科；2.醫(yī)學(xué)部，陜西西安 710061)

腎細(xì)胞癌簡稱腎癌(renal cell carcinoma，RCC)，是常見的泌尿系惡性腫瘤，其發(fā)病率占成人惡性腫瘤的2%～3%，其中腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)占70%～80%[1]。在我國，近年來腎癌的發(fā)病率有上升的趨勢，嚴(yán)重威脅人民的生命健康安全，與其他的腫瘤相比，腎癌因其原發(fā)性耐藥及耐放射等特性，傳統(tǒng)的治療方法除外科手術(shù)外，化療、放療、免疫治療等并不能起到良好的治療效果；對(duì)于晚期轉(zhuǎn)移性腎癌，即使患者接受了靶向治療，仍然有相當(dāng)部分患者出現(xiàn)靶向藥物治療失敗。因此，尋找及研究新型、高效的抗腎癌藥物仍然是目前泌尿外科研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

水飛薊賓是從菊科植物水飛薊的種子和果實(shí)中提取得到的黃酮類化合物，是最具生物活性的部分，在臨床上多用于保肝及抗氧化藥物。隨著近年研究的不斷深入，水飛薊賓新的藥理效應(yīng)和臨床價(jià)值不斷被人們所熟知，近年來其抗癌效果越來越受到人們的重視，既往文獻(xiàn)以及我們的前期研究報(bào)道中發(fā)現(xiàn)水飛薊賓在肝癌、乳腺癌、膀胱癌及前列腺癌等腫瘤中均發(fā)揮重要的抗癌作用[2-5]。我們研究團(tuán)隊(duì)圍繞水飛薊賓在泌尿系腫瘤中的作用，開展了一系列原創(chuàng)性研究，取得了階段性成績。在腎癌中，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)水飛薊賓可顯著抑制腎癌細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡[6]以及抑制其侵襲轉(zhuǎn)移能力[7]。但其確切分子機(jī)制仍未完全清楚。近年來腫瘤干細(xì)胞在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中的所起到的關(guān)鍵作用逐漸受到腫瘤研究者的大力關(guān)注，但是對(duì)于水飛薊賓是否影響腎癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性目前卻了解較少。

本實(shí)驗(yàn)旨在研究水飛薊賓對(duì)腎癌細(xì)胞干細(xì)胞特性的影響，從而探究水飛薊賓抗腎癌的新分子機(jī)制，為腎癌的臨床治療方法提供思路。另外，進(jìn)一步深入了解水飛薊賓發(fā)揮其抗腫瘤功能的分子機(jī)制基礎(chǔ)，可以對(duì)水飛薊賓在其他腫瘤治療中的應(yīng)用也具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1材料人腎癌細(xì)胞株786-O和ACHN購自美國ATCC細(xì)胞庫。RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；表皮細(xì)胞生長因子(epidermal growth factor，EGF)和成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growthfactor，bFGF)購自美國Sigma公司；B27購自美國Gibco公司；水飛薊賓購自美國Sigma公司；CD44和P63抗體購自美國abcam公司；β-catenin抗體和GSK3β/p-GSK3β抗體購自美國CST公司；β-ACTIN抗體購自沈陽萬類生物科技有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)人腎癌細(xì)胞株786-O和ACHN細(xì)胞均為貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，加入100 μg/mL的青霉素/鏈霉素，置于5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每2～3 d細(xì)胞換液，細(xì)胞貼壁達(dá)到80%時(shí)使用0.25%胰酶消化離心進(jìn)行傳代。

1.3Westernblot法檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)細(xì)胞胰蛋白酶消化離心后傳代，種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同處理，取出并棄去上清，用PBS沖洗3次加入RIPA細(xì)胞裂解液，冰上靜置1 min后刮下裂解物并轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，震蕩混勻30 s，冰上靜置10 min，4 ℃、15 000 r/min離心15 min，提取上清總蛋白。 Bradford法檢測各組蛋白濃度，30 μg樣品蛋白上樣經(jīng)SDS-PAGE凝膠分離，110 V電壓2 h轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗抗體在4 ℃搖床孵育過夜，次日TBST 洗膜10 min×3次，加入相應(yīng)的二抗室溫封閉1 h，TBST 洗膜10 min×3 次，使用ECL顯影液進(jìn)行顯影，使用Image J 軟件計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度比值。

1.4平板克隆形成實(shí)驗(yàn)收集對(duì)數(shù)期786-O和ACHN細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，以每孔1 000個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板內(nèi)培養(yǎng)，分別加入不同濃度水飛薊賓處理，置于含5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周。終止培養(yǎng)后使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，PBS沖洗后加入結(jié)晶紫色液染色20～30 min，以流水緩慢洗去染色液，空氣干燥后用肉眼直接計(jì)數(shù)克隆并拍照。

1.5腫瘤干細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)(Tumorsphere實(shí)驗(yàn)) 收集生長到對(duì)數(shù)期的腎癌細(xì)胞786-O和ACHN，胰酶消化后收集到離心管，離心后使用DMEM/F12無血清培養(yǎng)基(含EGF 20 ng/mL，bFGF 10 ng/mL，B27 2%)制成細(xì)胞懸液，以每孔4 000個(gè)細(xì)胞的密度接種于低粘附性24孔板內(nèi)，置于37 ℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周。再次收集細(xì)胞離心重懸，并更換新鮮DMEM/F12無血清培養(yǎng)基(含EGF 20 ng/mL，bFGF 10 ng/mL，B27 2%)繼續(xù)在相同環(huán)境下培養(yǎng)1周，倒置24孔板在顯微鏡下觀察拍照，并計(jì)數(shù)腫瘤球個(gè)數(shù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1水飛薊賓可通過劑量依賴的方式下調(diào)腎癌細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)結(jié)合我們前期已發(fā)表的研究成果，使用60 μmoL/L水飛薊賓(silibinin)處理786-O細(xì)胞以及80 μmoL/L水飛薊賓處理ACHN細(xì)胞24 h后均未引起明顯的細(xì)胞增殖抑制[6]，故我們首先使用不同濃度的水飛薊賓處理腎癌細(xì)胞系780-O和ACHN 24 h，通過Western blot技術(shù)檢測干細(xì)胞標(biāo)記物CD44以及P63蛋白表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，786-O細(xì)胞系(圖1A、B)和ACHN細(xì)胞系(圖1C、D)CD44和p63蛋白表達(dá)量隨著水飛薊賓劑量的增加而逐漸降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2水飛薊賓可通過時(shí)間依賴的方式下調(diào)腎癌細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)進(jìn)一步使用60 μmoL/L的水飛薊賓分別處理786-O細(xì)胞0、6、12、18、24 h，以及使用80 μmoL/L的水飛薊賓于相同的時(shí)間梯度下分別處理ACHN細(xì)胞，通過Western blot技術(shù)檢測CD44和p63蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，786-O細(xì)胞系(圖2A、B)和ACHN細(xì)胞系(圖2C、D)CD44和P63的表達(dá)量隨著水飛薊賓處理時(shí)間的延長而逐漸下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果提示了水飛薊賓可以通過時(shí)間-劑量依賴的方式下調(diào)腎癌細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)。

圖1水飛薊賓通過劑量依賴性的方式下調(diào)腎癌細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)

不同濃度水飛薊賓(silibinin)處理24 h后，使用Western blot檢測786-O細(xì)胞(A)及ACHN細(xì)胞(B)中CD44和P63蛋白水平變化；通過Image J軟件分析量化786-O細(xì)胞(C)及ACHN細(xì)胞(D)中CD44和P63蛋白灰度值相對(duì)內(nèi)參比值變化。與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

圖2 水飛薊賓可通過時(shí)間依賴的方式下調(diào)腎癌細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)

采用60 μmoL/L的水飛薊賓分別處理786-O細(xì)胞0、6、12、18、24 h，以及使用80 μmoL/L的水飛薊賓于相同的時(shí)間梯度下分別處理ACHN細(xì)胞，通過Western blot技術(shù)檢測786-O細(xì)胞(A)及ACHN細(xì)胞(C)CD44和P63蛋白的表達(dá)變化；通過Image J軟件分析量化786-O細(xì)胞(B)及ACHN細(xì)胞(D)中CD44和P63蛋白灰度值相對(duì)內(nèi)參比值變化。與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

2.3水飛薊賓抑制腎癌平板克隆形成在發(fā)現(xiàn)水飛薊賓可顯著下調(diào)腎癌干細(xì)胞標(biāo)記物的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)探討水飛薊賓對(duì)腎癌細(xì)胞克隆形成的影響。采用不同濃度梯度水飛薊賓分別作用于786-O和ACHN細(xì)胞1周，結(jié)果顯示，786-O細(xì)胞(圖3A、B)以及ACHN細(xì)胞(圖3C、D)平板克隆形成與空白對(duì)照相比均數(shù)量減少、體積減小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3水飛薊賓可通過劑量依賴的方式抑制腎癌平板克隆的形成

采用不同濃度梯度水飛薊賓分別作用于786-O和ACHN細(xì)胞1周，通過平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測786-O細(xì)胞(A)及ACHN細(xì)胞(C)克隆形成的能力；量化786-O細(xì)胞(B)及ACHN細(xì)胞(D)中克隆形成數(shù)目變化。與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2.4水飛薊賓抑制腫瘤干細(xì)胞克隆球形成腫瘤干細(xì)胞成球能力是腫瘤干細(xì)胞體外鑒定的重要方法。其判斷單個(gè)細(xì)胞在合適的條件培養(yǎng)基中自我更新的能力，一般用腫瘤干細(xì)胞克隆球數(shù)量表示。我們進(jìn)一步分別用水飛薊賓以60 μmoL/L處理786-O細(xì)胞系及80 μmoL/L處理ACHN細(xì)胞系。與對(duì)照組相比，水飛薊賓處理后786-O細(xì)胞(圖4A、B)以及ACHN細(xì)胞(圖4C、D)腫瘤干細(xì)胞克隆球數(shù)量減少、體積減小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。以上平板克隆形成以及腫瘤干細(xì)胞克隆球形成結(jié)果均表明了水飛薊賓可顯著影響腎癌細(xì)胞的干性。

圖4水飛薊賓抑制腎癌干細(xì)胞克隆球的形成(×100)

分別用水飛薊賓以60 μmoL/L處理786-O細(xì)胞系及80 μmoL/L處理ACHN細(xì)胞系，采用腫瘤干細(xì)胞克隆球形成實(shí)驗(yàn)檢測水飛薊賓對(duì)腎癌786-O(A、B)以及ACHN(C、D)干細(xì)胞克隆球形成數(shù)目的影響。與對(duì)照組相比，*P<0.05，

2.5水飛薊賓抑制腎癌Wnt/β-catenin信號(hào)通路Wnt/β-catenin信號(hào)通路在腫瘤干細(xì)胞的自我復(fù)制及分化過程中起著關(guān)鍵的作用。我們進(jìn)一步采用不同濃度梯度水飛薊賓處理腎癌細(xì)胞系780-O和ACHN 24 h，通過Western Blot技術(shù)檢測Wnt/β-catenin信號(hào)通路中關(guān)鍵激酶及蛋白GSK3β/p-GSK3β和β-catenin蛋白表達(dá)量的變化。同對(duì)照組相比，786-O細(xì)胞系(圖5A、B)和ACHN細(xì)胞系(圖5C、D)p-GSK3β和β-catenin蛋白表達(dá)量隨著水飛薊賓劑量的增加而逐漸降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖5水飛薊賓可通過濃度依賴的方式抑制腎癌Wnt/β-catenin通路

不同濃度水飛薊賓(silibinin)處理24 h后，使用Western blot檢測786-O細(xì)胞(A)及ACHN細(xì)胞(C)中GSK3β/p-GSK3β和β-catenin蛋白水平變化；通過Image J軟件分析量化786-O細(xì)胞(B)及ACHN細(xì)胞(D)中p-GSK3β和β-catenin蛋白灰度值相對(duì)內(nèi)參比值變化。與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

3 討 論

腫瘤干細(xì)胞具有自我更新、無限增殖和多向分化的潛能，雖然數(shù)量少，但卻在腫瘤的生長、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和多藥耐藥中起重要作用。泌尿系腫瘤干細(xì)胞的研究起步稍晚，但也取得了很顯著的進(jìn)展，前列腺癌和膀胱癌目前均已經(jīng)有了國際公認(rèn)的干細(xì)胞表面分子標(biāo)記物。而腎癌腫瘤干細(xì)胞的研究也尚處于起步階段。

FLOREK等利用體外球體形成實(shí)驗(yàn)從腎癌細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)腎癌干細(xì)胞，證實(shí)了腎癌干細(xì)胞的存在。BUSSOLATI等[8]在腎癌中分選得到CD133+細(xì)胞，通過克隆形成體外實(shí)驗(yàn)及小鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)等干細(xì)胞生物學(xué)特性鑒定，證明了CD133是腎癌干細(xì)胞的待選表面標(biāo)記分子，為腎癌干細(xì)胞篩選帶來一定啟發(fā)。此后陸續(xù)又發(fā)現(xiàn)了一系列與腎癌干細(xì)胞密切相關(guān)的表明標(biāo)記物及分子。但遺憾的是目前尚無公認(rèn)的腎癌腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志。CD133、CD24、CD44、CD105、CTR2、Rh123、P63和Oct4都曾作為干細(xì)胞表面標(biāo)記物用于腎癌腫瘤干細(xì)胞的分選研究。腎癌干細(xì)胞表明標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用也為更深刻的理解腎癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制以及開發(fā)新型高效的靶向特異性藥物奠定了基礎(chǔ)。

傳染保肝藥水飛薊賓今年來因其抗廣譜抗腫瘤作用已經(jīng)受到了廣泛的關(guān)注。既往文獻(xiàn)報(bào)道，水飛薊賓可抑制乳腺癌、膠質(zhì)瘤[9]以及肺癌[10]干細(xì)胞特性，進(jìn)而發(fā)揮其抗腫瘤效果。我們研究團(tuán)隊(duì)圍繞水飛薊賓在包括前列腺癌、膀胱癌以及腎癌在內(nèi)的多種泌尿系腫瘤中的作用也開展了一系列研究。我們前期研究成果發(fā)現(xiàn)，水飛薊賓可顯著抑制膀胱癌的干細(xì)胞特性，進(jìn)而抑制膀胱癌的侵襲及轉(zhuǎn)移能力[4]。而水飛薊賓在腎癌中對(duì)干細(xì)胞特性是否影響目前尚不清楚。Western blot法檢測水飛薊賓對(duì)腎癌細(xì)胞系786-O和ACHN干細(xì)胞標(biāo)志物影響，發(fā)現(xiàn)水飛薊賓下調(diào)干細(xì)胞標(biāo)志物CD44、P63表達(dá)，并且呈現(xiàn)濃度依賴性和時(shí)間依賴性。同時(shí)，通過平板克隆實(shí)驗(yàn)和腫瘤干細(xì)胞克隆球?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)，水飛薊賓處理后平板克隆及克隆球體積明顯減小、數(shù)量明顯減少，有力的證實(shí)了水飛薊賓抑制腎癌細(xì)胞干細(xì)胞特性的作用。

Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號(hào)途徑參與調(diào)控細(xì)胞形態(tài)與功能分化、細(xì)胞癌變、凋亡、免疫與應(yīng)激等，在胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生和器官纖維化等病理生理過程中發(fā)揮重要作用[11]。在穩(wěn)定狀態(tài)下，Wnt信號(hào)缺失導(dǎo)致胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin被糖原合成酶激酶(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)磷酸化而降解；Wnt信號(hào)通路激活時(shí)GSK3β磷酸化作用被抑制，引起胞內(nèi)β-catenin降解減少，β-catenin積聚增多向核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，β-catenin與核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF相互作用調(diào)控下游靶基因表達(dá)[12]。研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號(hào)途徑與腫瘤干細(xì)胞特性有密切關(guān)系[13]，過表達(dá)β-catenin引起頭頸部鱗狀細(xì)胞癌干細(xì)胞Oct4表達(dá)升高，自我更新能力和成瘤性增強(qiáng)[14]。在膀胱腫瘤中，我們前期研究也發(fā)現(xiàn)水飛薊賓可通過Wnt/GSK3β/β-catenin信號(hào)通路抑制膀胱腫瘤的干性，進(jìn)而抑制膀胱腫瘤的侵襲潛能。在本研究中，我們通過Western-blot檢測p-GSK3β及β-catenin蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)水飛薊賓能夠明顯下調(diào)p-GSK3β及β-catenin表達(dá)，顯示水飛薊賓可能通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮抗腎癌干細(xì)胞特性的作用；但仍需要后續(xù)進(jìn)一步的干預(yù)或者回復(fù)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證Wnt/β-catenin信號(hào)通路在該過程中發(fā)揮的確切作用。

綜上所述，水飛薊賓能夠明顯抑制腎癌細(xì)胞干細(xì)胞特性，抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路是其可能的分子機(jī)制。進(jìn)一步深入探討水飛薊賓抑制腎癌細(xì)胞干性的分子機(jī)制，將有可能為晚期腎癌的綜合治療帶來新的選擇。

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