光學(xué)顯微鏡自動(dòng)聚焦算法研究

呂美妮， 玉振明

(1. 桂林電子科技大學(xué)信息與通信學(xué)院，廣西 桂林 541004;2. 梧州學(xué)院 廣西高校圖像處理與智能信息系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 梧州 543002)

0 引 言

自動(dòng)聚焦技術(shù)是光學(xué)顯微鏡成像系統(tǒng)中至關(guān)重要的技術(shù)，決定其準(zhǔn)確度、效率和穩(wěn)定性。自動(dòng)聚焦技術(shù)主要分為主動(dòng)式和被動(dòng)式[1]。主動(dòng)式聚焦技術(shù)主要通過測量被測物體與成像面的距離，再利用成像原理計(jì)算出離焦量。被動(dòng)式聚焦技術(shù)是基于數(shù)字圖像處理，通過對(duì)采集到的圖像進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，判斷當(dāng)前圖像的聚焦程度。由于被動(dòng)式聚焦技術(shù)不需要添加額外的傳感器，僅利用獲取的圖像序列就能進(jìn)行分析系統(tǒng)的聚焦?fàn)顟B(tài)，因此近年來得到廣泛應(yīng)用[2]。被動(dòng)式自動(dòng)聚焦技術(shù)主要分為兩類：一類是聚焦深度法（depth from focus，DFF）；另一類是離焦深度法（depth from defocus，DFD）[3]。DFD需要建立一定的數(shù)學(xué)模型，通過分析離焦圖像信息，確定模糊程度和離焦圖像的關(guān)系，估算出當(dāng)前位置與聚焦位置的距離。但由于各成像系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)不同，建立數(shù)學(xué)模型所需的參數(shù)存在一定的差異，故DFD在實(shí)際應(yīng)用中并不廣泛。而DFF無需建立復(fù)雜的數(shù)學(xué)模型，只需要通過分析圖像的分布特點(diǎn)來靈活選取聚焦窗口以及評(píng)價(jià)函數(shù)，適用性較高。其中，聚焦深度法主要包括3個(gè)核心問題：聚焦窗口的選擇，聚焦評(píng)價(jià)函數(shù)的選取和搜索算法的布置[4]。

本文主要研究聚焦窗口的選擇以及聚焦評(píng)價(jià)函數(shù)的選取。在聚焦窗口選擇算法方面，針對(duì)傳統(tǒng)的聚焦窗口選擇方法不能靈活選取聚焦區(qū)域的問題，提出一種根據(jù)圖像子塊梯度幅值總和變化量的聚焦窗口選擇方法。而在選取聚焦評(píng)價(jià)函數(shù)方面，針對(duì)傳統(tǒng)的聚焦函數(shù)受噪聲影響而引起曲線失去理想特性的問題，提出一種基于梯度和方差的改進(jìn)算法。

1 聚焦窗口

聚焦窗口的選取直接影響著后續(xù)聚焦算法的計(jì)算量、復(fù)雜度和準(zhǔn)確度[5]。傳統(tǒng)的聚焦窗口選擇方法有中央選擇法[6-7]、倒T型選擇法[8]和黃金多點(diǎn)選擇法[9]等。這些方法一般先假設(shè)被測目標(biāo)的位置是固定的，或其分布有一定的規(guī)律性，一旦被測目標(biāo)偏離或是遇到稀疏內(nèi)容圖像時(shí)，傳統(tǒng)的方法具有一定局限性。所以尋求更靈活的聚焦窗口選擇方法成為研究的熱點(diǎn)。

1.1 理論知識(shí)

圖像均值可以作為圖像分割的閾值，以此大致區(qū)分背景區(qū)域和目標(biāo)區(qū)域。基于此原理，對(duì)顯微圖像序列進(jìn)行分塊，主要分為零內(nèi)容子塊（包括邊緣含有部分內(nèi)容區(qū)域，可忽略不計(jì)）、稀疏內(nèi)容子塊（內(nèi)容區(qū)域占子塊內(nèi)容的比小于等于1/2）和豐富內(nèi)容子塊（內(nèi)容區(qū)域占子塊內(nèi)容的比大于1/2）3種。通過分析，不難看出零內(nèi)容子塊的每個(gè)像素灰度值幾乎都大于圖像均值，豐富內(nèi)容子塊的每個(gè)像素灰度值幾乎小于圖像均值，而稀疏內(nèi)容子塊中，如果是包含較少內(nèi)容區(qū)域，子塊中像素灰度值大于圖像均值的像素個(gè)數(shù)占多數(shù)；反之，如果包含較多內(nèi)容區(qū)域，子塊中像素灰度值小于圖像均值的像素個(gè)數(shù)占多數(shù)。

為了驗(yàn)證子塊均值與圖像均值之間的關(guān)系，本文利用光學(xué)顯微鏡XSZ-8100采集內(nèi)容豐富程度不同的圖像序列（離焦-聚焦-離焦），進(jìn)行分析整理，數(shù)據(jù)取其平均值。對(duì)圖像內(nèi)容稀疏的圖像序列，因其含有內(nèi)容區(qū)域的子塊較少，故內(nèi)容子塊中含內(nèi)容區(qū)域較少的子塊，統(tǒng)一歸為零內(nèi)容子塊（不考慮玻片雜質(zhì)的影響）。

從表1可以看出，對(duì)于圖像內(nèi)容豐富和相對(duì)豐富的圖像序列，豐富內(nèi)容子塊的均值一般分布在[E-20,E-10]內(nèi)，在此范圍內(nèi)也含有一部分的其他兩類子塊，但豐富內(nèi)容子塊數(shù)量占圖像子塊總數(shù)的比例較大，而在小于E-20的范圍內(nèi)，雖然在此范圍內(nèi)也含有一部分的其他兩類子塊，但含大部分內(nèi)容子塊的數(shù)量占了很大的比例，并且子塊數(shù)量占圖像子塊總數(shù)的比例較小，故閾值選取在E-20能初步判定聚焦窗口的大致區(qū)域，剔除大量的無用圖像子塊。在圖像內(nèi)容較稀疏的情況下，因豐富內(nèi)容子塊較少，閾值選取在任何范圍內(nèi)，零內(nèi)容子塊所占的比例較大，故后續(xù)介紹的方法適用于除稀疏內(nèi)容圖像（目標(biāo)區(qū)域零星分布）之外的任意顯微圖像序列。

表1 圖像子塊均值分布范圍表1）%

1.2 聚焦窗口選擇算法

本文的聚焦窗口選擇算法先通過表1設(shè)定閾值剔除大量的無用子塊，再根據(jù)子塊的梯度幅值總和的變化量確定聚焦窗口。具體步驟如下：

1）對(duì)像素大小為M×N的圖像f求圖像均值：

其中f(x,y)為圖像像素點(diǎn)(x,y)處的灰度值。

2）把圖像分割為w×w大小的m×n個(gè)子塊，根據(jù)式（1）求圖像子塊均值：

其中為圖像子塊坐標(biāo)。

3）根據(jù)子塊均值大小對(duì)子塊進(jìn)行二值化處理：

同時(shí)根據(jù)子塊二值化結(jié)果對(duì)圖像塊進(jìn)行篩選，保留S(i,j)>0的子塊，剔除大量無用的子塊S(i,j)<0。

4）定義圖像在點(diǎn)(x,y)處的梯度為

因此子塊(i,j)的梯度幅值變化總和為

因此沿Z軸移動(dòng)子塊(i,j)梯度幅值總和差值為

其中H′(i,j)為顯微鏡載物臺(tái)沿Z軸移動(dòng)一小段距離后同一位置子塊的梯度幅值總和。

判斷圖像子塊是否滿足式（4）～式（6），若滿足要求，則從滿足條件的圖像子塊中選取E(i,j)變化最大的兩個(gè)圖像子塊作為聚焦窗口。

在聚焦過程中，只有內(nèi)容像素的梯度幅值發(fā)生顯著變化，而雜質(zhì)像素和背景像素的梯度幅值基本不變[10]。內(nèi)容子塊的E(i,j)變化較為明顯，零內(nèi)容子塊的E(i,j)基本不變（或在一定的范圍內(nèi)波動(dòng)），故選取E(i,j)變化最大的兩個(gè)子塊作為最終的聚焦窗口。

2 聚焦評(píng)價(jià)函數(shù)

傳統(tǒng)的聚焦函數(shù)分為3類：梯度類評(píng)價(jià)函數(shù)、頻域類評(píng)價(jià)函數(shù)和統(tǒng)計(jì)類評(píng)價(jià)函數(shù)[11-12]。其中基于頻域的聚焦評(píng)價(jià)函數(shù)比較復(fù)雜，計(jì)算量大，在實(shí)際應(yīng)用中并不多。而基于梯度類函數(shù)與統(tǒng)計(jì)類函數(shù)因計(jì)算簡單，在實(shí)際應(yīng)用較為廣泛。

傳統(tǒng)的聚焦評(píng)價(jià)函數(shù)易受噪聲的影響，引起函數(shù)性能下降，進(jìn)而導(dǎo)致聚焦的不準(zhǔn)確。本文提出一種基于梯度和方差的改進(jìn)算法，該算法將梯度評(píng)價(jià)函數(shù)與方差評(píng)價(jià)函數(shù)結(jié)合，利用每個(gè)像素的權(quán)重進(jìn)行加權(quán)，計(jì)算簡單且能提高其靈敏度、清晰度比率和抗噪性。

在傳統(tǒng)的聚焦評(píng)價(jià)函數(shù)中，Tenengrad函數(shù)是性能比較優(yōu)異的梯度類函數(shù)。該函數(shù)基于Sobel算子，由于Sobel算子結(jié)合了高斯平滑和微分，所以Tenengrad函數(shù)對(duì)噪聲具有很強(qiáng)的穩(wěn)健性。故本文選用性能較好的Tenengrad函數(shù)來構(gòu)建新的聚焦評(píng)價(jià)函數(shù)。

對(duì)圖像f每個(gè)像素點(diǎn)(x,y)的水平及垂直差分進(jìn)行平方運(yùn)算，在一定程度上可起到抗噪聲的作用。

其中g(shù)x(x,y)和gy(x,y)分別表示圖像與水平和垂直Sobel算子的卷積。

由于清晰圖像一般比離焦圖像具有更大的梯度變化，因此圖像的梯度值方差同樣也可以區(qū)分內(nèi)容像素和背景像素。故對(duì)每個(gè)像素點(diǎn)的p(x,y)進(jìn)行求方差，方差反映數(shù)據(jù)波動(dòng)的大小，可看出每個(gè)像素點(diǎn)p(x,y)的偏離程度。

其中是圖像每個(gè)像素點(diǎn)p(x,y)的平均值。

不同的像素有不同的作用，而在聚焦過程中，背景像素和雜質(zhì)像素會(huì)影響聚焦函數(shù)的曲線性能，為了減少其影響，對(duì)q(x,y)用像素的灰度值權(quán)重進(jìn)行加權(quán)。

其中T為圖像的灰度平均值，F(xiàn)為聚焦評(píng)價(jià)函數(shù)值。在聚焦過程中，背景像素和雜質(zhì)像素的灰度值基本不變（或變化很?。?，而內(nèi)容像素的灰度值發(fā)生顯著的變化。利用這個(gè)性質(zhì)，可以發(fā)現(xiàn)在聚焦過程中，內(nèi)容像素的灰度值權(quán)重越來越大。通過對(duì)q(x,y)進(jìn)行加權(quán)，使得內(nèi)容像素的q(x,y)比重加大，而背景像素和雜質(zhì)像素的q(x,y)比重減少，進(jìn)一步突出了聚焦圖像和離焦圖像的區(qū)別，在一定程度上提高了聚焦函數(shù)的靈敏度。

3 實(shí)驗(yàn)與分析

本文實(shí)驗(yàn)壞境為：CPU，Intel（R）Core（TM）i7-6700 3.4GHz；RAM，8.00GB；Matlab（R2014a）。

本文實(shí)驗(yàn)圖片（480×640）均通過梧州奧卡光學(xué)儀器公司研發(fā)的光學(xué)顯微鏡（XSZ-8100）進(jìn)行采集。實(shí)驗(yàn)中選用2組圖像大小為480×640的顯微圖像序列（離焦-聚焦-離焦），聚焦圖像如圖1（a）～圖1（b）所示。圖中所示的圖像序列，最佳聚焦位置在第41幀。

圖1 顯微圖像序列

圖2 取窗方法對(duì)比曲線圖

3.1 聚焦窗口選擇實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證本文方法的有效性，分別與中心選擇法、多點(diǎn)選擇法和倒T選擇法進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，聚焦評(píng)價(jià)函數(shù)采用性能優(yōu)異的Tenengrad函數(shù)。實(shí)驗(yàn)仿真結(jié)果如圖2所示。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，對(duì)于內(nèi)容豐富的圖像序列(圖1（a）），傳統(tǒng)的方法和本文方法都能夠使聚焦評(píng)價(jià)函數(shù)曲線具有單峰性，不存在局部峰值。這是由于圖像內(nèi)容豐富，傳統(tǒng)的取窗方法也能納入更多的圖像內(nèi)容。而當(dāng)被測物體偏離中心區(qū)域（圖1（b）），在取窗足夠大的情況下，傳統(tǒng)的取窗方法能納入一部分的圖像內(nèi)容，但由于納入的非內(nèi)容區(qū)域過多，會(huì)導(dǎo)致曲線出現(xiàn)局部極值，而本文方法的曲線還能保持曲線的單峰性?？梢姳疚姆椒艽_保選取到含有大量內(nèi)容區(qū)域的子塊作為聚焦窗口。

3.2 聚焦函數(shù)性能實(shí)驗(yàn)

3.2.1 仿真實(shí)驗(yàn)

為驗(yàn)證本文函數(shù)的性能，選取Variance函數(shù)[13]、Robert函數(shù)[14]、EOG函數(shù)[15]、Tenengrad函數(shù)[15]以及文獻(xiàn)[16]的SV函數(shù)（Sobel函數(shù)和方差函數(shù)結(jié)合）進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。聚焦窗口的選取方法則選用本文1.2所提的方法。圖3（a）是無噪聲情況下的仿真曲線。圖3（b）則是圖像序列加入隨機(jī)噪聲的仿真曲線。

圖3 聚焦函數(shù)仿真曲線圖

由圖可知，當(dāng)無噪聲干擾時(shí)，傳統(tǒng)的聚焦評(píng)價(jià)函數(shù)和本文函數(shù)均滿足單峰性和無偏性，且保持理想曲線的特性，但本文函數(shù)靈敏度更高。當(dāng)有噪聲干擾時(shí)，本文函數(shù)的仿真曲線還能保持單峰性和無偏性，且平緩區(qū)波動(dòng)較小，而其他評(píng)價(jià)函數(shù)的仿真曲線波動(dòng)較明顯，失去理想曲線的特性，說明本文函數(shù)具有較好的穩(wěn)定性。

3.2.2 結(jié)果分析

為了驗(yàn)證本文算法性能上的改進(jìn)，利用文獻(xiàn)[15]中提出的評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)各聚焦函數(shù)進(jìn)行定量分析。

清晰度比率表達(dá)式為

其中Fmax和Fmin為聚焦函數(shù)的最大值和最小值（最小值應(yīng)在聚焦曲線的平緩區(qū)取得）。

靈敏度因子表達(dá)式為

其中x1為橫坐標(biāo)變化量，xmax為函數(shù)最大值的橫坐標(biāo)。

首先假設(shè)采樣點(diǎn)有N個(gè)（曲線的平緩區(qū)取得），則定義N個(gè)點(diǎn)的函數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)差為平緩區(qū)波動(dòng)量，其表達(dá)式為

其中為平緩區(qū)的灰度均值。

對(duì)各函數(shù)進(jìn)行定量分析如表2所示，給出在隨機(jī)噪聲的影響下，各函數(shù)的清晰度比率（R）、靈敏度因子（S）、平緩區(qū)波動(dòng)量（V）和處理時(shí)間（T）。

表2 圖像在噪聲干擾下各聚焦函數(shù)性能指標(biāo)

從表2可以看出，本文函數(shù)的靈敏度明顯高于其他函數(shù)，說明本文函數(shù)在有噪聲的影響下，函數(shù)最大值附近變化劇烈，適用于細(xì)聚焦過程。本文函數(shù)的清晰度比率明顯高于其他函數(shù)，說明本文函數(shù)在有噪聲的情況下，對(duì)不同離焦程度的圖像分辨能力強(qiáng)，這也說明該函數(shù)抗噪聲能力較強(qiáng)。本文函數(shù)的平緩區(qū)波動(dòng)量小，說明該函數(shù)在噪聲的干擾下還能保持平緩區(qū)波動(dòng)平衡，穩(wěn)定性較強(qiáng)。從時(shí)間來看，本文函數(shù)相比于傳統(tǒng)聚焦評(píng)價(jià)函數(shù)，時(shí)間相差不大。本文提出的算法是基于文獻(xiàn)[16]的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)的，相比于文獻(xiàn)[16]的SV算法，本文算法的清晰度比率、靈敏度因子和平緩區(qū)波動(dòng)量都有了提高，并且實(shí)驗(yàn)用時(shí)比SV函數(shù)少。

從以上分析的結(jié)果來看，本文提出的算法在抗噪性、靈敏度和穩(wěn)定性方面具有一定的優(yōu)勢，且適用于光學(xué)顯微成像系統(tǒng)。

4 結(jié)束語

在光學(xué)顯微鏡系統(tǒng)聚焦的過程中，傳統(tǒng)的聚焦窗口選擇方法并不能滿足聚焦的要求，一旦目標(biāo)區(qū)域偏離中心區(qū)域或是目標(biāo)區(qū)域較小，往往都會(huì)導(dǎo)致聚焦失敗。本文提出的新算法能選取到含內(nèi)容區(qū)域較多的圖像塊作為聚焦窗口。聚焦評(píng)價(jià)函數(shù)是自動(dòng)聚焦的核心問題之一，一個(gè)理想的聚焦函數(shù)，應(yīng)該滿足無偏性、單峰性和抗噪性。本文提出的算法在噪聲的干擾下，具有較高的靈敏度、穩(wěn)定性和抗噪性。綜上，本文提出的聚焦窗口選取方法以及聚焦評(píng)價(jià)函數(shù)適用于顯微成像系統(tǒng)中。

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