陳冠旭，秦貴龍，李恩廣，趙春梅，喬利仙，2，王晶珊，2，隋炯明，2

(1.青島農業(yè)大學 生命科學學院，山東 青島 266109；2.青島農業(yè)大學 農學院，山東省旱作技術重點實驗室，山東 青島 266109)

PP2C(PP2C-type protein phosphatase)是一類單體絲氨酸/蘇氨酸殘基蛋白磷酸酶[1-2]，其活性依賴于Mg2+或Mn2+等二價陽離子，并且嚴格受其調節(jié)。進化分析表明，PP2C蛋白在進化過程中相對保守[3]，它廣泛存在于低等生物和高等生物中，而且在植物中PP2C基因的數(shù)量最多[4]。目前，在擬南芥、玉米、水稻等植物中都篩選出了大量PP2C基因[5]。Liu等[6]報道了一個擬南芥基因AtPP2CG1，該基因編碼的蛋白屬于PP2C家族的G亞族，能夠調控擬南芥對鹽脅迫的響應，且其調控依賴于ABA。Schweighofer等[7]報道了擬南芥中76個PP2C基因，并將它們分成10個組。Xue等[8]利用生物信息學手段從水稻和擬南芥基因組中分別分離出78，80個PP2C基因，并分別將它們分為11，13個組。擬南芥中，A亞族的9個成員中包含6個負調控ABA信號的蛋白：ABI1、ABI2、AHG1、AHG3/AtPP2CA、HAB1和HAB2[9]。在胡楊中也證實了A亞族的PeHAB1基因是ABA信號途徑中的調控基因[10-11]。在苜蓿中發(fā)現(xiàn)了一種受逆境脅迫誘導的屬于B亞族的PP2C(MP2C)蛋白，是MAPK途徑中的負調控因子[12]。C亞族的PP2C基因與花的器官發(fā)育有關[13]；而關于PP2C基因其他亞族的研究并不多。

Bhalothia等[14]在擬南芥和煙草中研究發(fā)現(xiàn)，PP2C通過催化可逆磷酸化，反作用于特定的蛋白激酶，下游信號負調控ABA信號通路，可以加速植物的發(fā)育以及增強植物對逆境脅迫的耐受性。但是到目前為止，油料作物中有關PP2C基因的研究很少，更未見它們在花生中功能研究的報道。

前期試驗中，以花生的胚小葉作為外植體，使用平陽霉素作為誘變劑進行離體誘變，然后用羥脯氨酸作為篩選壓對愈傷組織定向篩選，獲得了一批羥脯氨酸耐性苗及其后代[15]，其中1個突變體(S2)在0.7% NaCl溶液中發(fā)芽率超過50%，且具有較高的SOD和POD值，而對照花育20(S4)在相同濃度的NaCl溶液中發(fā)芽率只有6.7%。本研究以測序完成的轉錄組和表達譜為基礎[16]，利用生物信息學研究手段，在整個轉錄組水平上篩選PP2C家族成員，進行了PP2C基因的染色體定位和分類；利用在鹽脅迫處理前后測序獲得的多個時間段的表達譜，鑒定鹽脅迫響應相關的PP2C基因，并進行分子進化分析，尋找氨基酸的保守功能域和啟動子區(qū)域的保守順式調控元件。本研究將為探討花生PP2C基因的耐鹽功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

利用平陽霉素(Pingyangmycin)作為化學誘變劑，對花生品種花育20(S4)進行離體誘變，使用羥脯氨酸(Hydroxyproline，HYP) 作為篩選壓，在MSB5有機培養(yǎng)基中進行定向篩選，從后代中鑒定出1個在0.7% NaCl處理下發(fā)芽率顯著高于誘變親本，且可穩(wěn)定遺傳的耐鹽突變體(S2)。

1.2 試驗方法

1.2.1 轉錄組數(shù)據(jù)庫構建 沙培法將耐鹽突變體S2和對照S4的種子培養(yǎng)至幼苗期(約21～28 d)，用250 mmol/L NaCl溶液處理幼苗，在分別處理0，6，12，24，48 h后取葉片，每個樣品包含2個生物學重復。將樣品混合后，送交測序公司進行雙向測序，構建轉錄組文庫，處理數(shù)據(jù)后在NCBI數(shù)據(jù)庫注冊(注冊號SRR3114511)。用PFAM、NR、KEGG、KOG、SwissProt、GO、NT等數(shù)據(jù)庫進行基因功能注釋。

1.2.2 鹽脅迫處理前后表達譜數(shù)據(jù)庫構建 采用Solexa技術對鹽脅迫處理前后的20個樣品進行數(shù)字化表達譜測序，構建花生葉片鹽脅迫處理前后的表達譜數(shù)據(jù)庫，并以上述轉錄組數(shù)據(jù)庫為參考，對整理后的表達譜數(shù)據(jù)庫Unigene序列進行分析，并在NCBI數(shù)據(jù)庫注冊(注冊號SRR3210665和SRR3210666)。

1.2.3PP2C基因家族成員鑒定、基因結構分析和染色體定位 根據(jù)上述7大數(shù)據(jù)庫所得到的基因功能注釋結果，搜索PP2C基因。將其與花生全基因組數(shù)據(jù)(http：//www.peanutbase.org)中的A組野生種基因組序列進行比對，下載同源性最高的序列。將同源序列翻譯成蛋白后，利用DNAMAN分析花生PP2C各個成員的蛋白分子量和理論等電點等信息。根據(jù)基因在A組野生種基因組序列和轉錄組序列比對結果，使用在線工具(Gene Structure Display Server 2.0)進行基因結構分析，得到其外顯子-內含子結構圖。根據(jù)與花生全基因組數(shù)據(jù)庫比對后基因位置的結果，進行染色體定位，得到各個基因在染色體上的分布結果。

1.2.4 系統(tǒng)進化樹的構建和同源比對分析 通過Clustal X軟件對擬南芥和花生PP2C蛋白進行多重序列比對分析，然后用軟件MEGA 6.0 生成PP2C基因的系統(tǒng)進化樹。

1.2.5 鹽脅迫響應分析 利用鹽脅迫處理前后S2和S4的20個數(shù)字表達文庫譜，分析PP2C基因在脅迫處理前后的任何2個時間段的表達量，如果調整后的P值< 0.05，則認為該基因對鹽脅迫有響應。

1.2.6PP2C基因啟動子順式調控元件分析 選取受鹽脅迫誘導表達的PP2C基因，利用Plantcare軟件分析其啟動子的順式調控元件。

2 結果與分析

2.1 花生葉片轉錄組數(shù)據(jù)庫的構建及PP2C家族基因的篩選

根據(jù)上述7大數(shù)據(jù)庫的基因功能預測，搜索PP2C基因，最終篩選出79個具有完整開放閱讀框的PP2C基因(圖1)。

圖1 79個PP2C基因在花生A基因組染色體上的位置Fig.1 The location of the 79 PP2C genes on the chromosomes of A genome from peanut

這79個PP2C基因共分布于花生A組野生種10條染色體上。其中，數(shù)量最多的，有15個成員分布在第9號染色體；其次為第1號和8號染色體，分別有11，12個PP2C基因，而第2號染色體上只有1個PP2C基因(圖1)。花生PP2C蛋白大小在不同成員間差別很大，為78～1 398個殘基，其等電點為4.14～10.21。基因結構分析顯示，外顯子個數(shù)2～23個 (圖2)。

2.2 花生PP2C基因的聚類和同源比對分析

擬南芥中的PP2C基因可分為A～L 13個亞族，16個亞類。將篩選到的79個花生PP2C基因，與擬南芥的PP2C基因進行了多重序列比對和系統(tǒng)進化分析，結果表明，花生的絕大多數(shù)PP2C基因聚到除B亞族外的12個亞族，可分為15個亞類(圖3)。

2.3 鹽脅迫處理前后花生葉片表達譜數(shù)據(jù)庫的構建及PP2C基因的鹽脅迫響應分析

利用鹽脅迫處理前后S2和S4材料的20個數(shù)字表達文庫譜，對79個PP2C基因在鹽脅迫處理前后的任何2個時間段的表達量進行差異分析，根據(jù)調整后的P值，共篩選出35個PP2C基因受鹽脅迫誘導表達(圖4、表1)，涉及12個亞族14個亞類，其中A亞族b亞類、G亞族b亞類、I亞族、L亞族所有成員均受鹽脅迫誘導表達，而G亞族a亞類的所有成員均不受鹽脅迫誘導表達。

進一步分析發(fā)現(xiàn)，35個PP2C基因中，7個基因(c38994_g1、c32376_g1、c9698_g1、c43142_g1、c34581_g2、c34200_g1和c24765_g1)只在S2中受鹽脅迫誘導表達；7個基因(c25744_g1、c42931_g1、c38232_g1、c34126_g1、c32418_g1、c32619_g2和c37903_g2)只在S4中受鹽脅迫誘導表達，其余21個基因在S2和S4中均受鹽脅迫誘導表達。

在S2中，與脅迫處理前相比，6 h出現(xiàn)差異表達的基因數(shù)目最多，有23個，其中8個上調，15個下調；在48 h只有1個基因出現(xiàn)差異表達。而在S4中，與脅迫處理前相比，12 h出現(xiàn)差異表達的基因數(shù)目最多，共有18個差異基因，其中11個下調，7個上調；24 h出現(xiàn)差異表達的基因數(shù)目最少，只有3個(圖5)。

圖2 79個花生PP2C基因的結構示意圖Fig.2 The structure diagram of 79 PP2C genes in peanut

圖3 花生與擬南芥PP2C基因的聚類分析Fig.3 The clustering analysis of PP2C genes in peanut and Arabidopsis

圖4 鹽脅迫處理前后35個PP2C基因的表達情況Fig.4 Expression of 35 PP2C genes before and after salt stress treatment

亞族Subgroups亞類Subclasses受鹽脅迫誘導基因數(shù)The number of genes responsive to salinity stress基因代號Gene ID受鹽脅迫誘導基因數(shù)/總基因數(shù)The number of genes responsive to salinity stress/The number ofPP2C genesAa2c38232_g1、c42931_g12/4b2c36899_g1、c40455_g22/2B00/0C2c39126_g2、c41528_g12/10D5c34581_g2、c34581_g1、c38994_g1、c39003_g1、c25744_g15/11Ea3c30618_g1、c45163_g1、c25828_g13/7b3c35944_g1、c32418_g1、c32619_g23/4F12c43117_g1、c24765_g12/4F21c37903_g21/2Ga00/2b3c34126_g1、c43142_g1、c36599_g13/3H3c35011_g1、c33691_g1、c56870_g13/6I3c24443_g1、c37777_g2、c24598_g13/3J1c44239_g11/2K3c39153_g2、c9698_g1、c41013_g13/7L2c41121_g1、c43819_g12/2

S2.耐鹽突變體；S4.HY20 CK；例如：S2_6vsS2_0表示S2中處理6 h后與處理0 h表達量顯著差異的基因的數(shù)目，黑色代表上調，數(shù)目為8個；白色代表下調，數(shù)目為15個；依次類推。S2.Salt tolerant mutant；S4.HY20 CK；For example：S2_6vsS2_0 indicates the number of genes that are significantly different in expression of treatment 6 hours and 0 hours in S2，with black representing up-regulation，the number of which is 8，white representing down-regulation，the number of which is 15；and so on.

2.4 PP2C基因啟動子順式調控元件分析

選取這35個受鹽脅迫誘導表達的PP2C基因，利用Plantcare等軟件分析其啟動子的順式調控元件。研究發(fā)現(xiàn)分別有91%，80%，83%和80%的PP2C基因啟動子含有HSE、MBS、TC-rich repeats和ARE這些脅迫響應元件(圖6)。

圖6 35個花生PP2C基因啟動子順式調控元件分析Fig.6 Analysis of cis-regulatory elements of the promoters of 35 PP2C genes in peanut

3 結論與討論

PP2C是一類具有多種功能的蛋白磷酸酶。目前，已經有許多文章在不同的模式生物中對PP2C的多個成員進行了特性分析以及鑒定。例如，MP2C是一個從苜蓿cDNA文庫中篩選到的參與MAPK信號級聯(lián)通路的PP2C類基因，直接作用于MAPK信號途徑中通過酵母雙雜交鑒定出的SIMK(Stress induced MAPK)，MP2C通過對SIMK中pTEpY序列的蘇氨酸殘基去磷酸化使SIMK信號途徑失活[17-18]。研究表明，植物受到創(chuàng)傷后葉片中的MP2C大量表達，而SIMK途徑隨著MP2C的表達而逐漸失活，說明MP2C是SIMK途徑的負調控因子[19-20]。玉米ZmPP2C基因在鹽和干旱脅迫反應中作為一個負調控因子[21]。另有一些相關試驗驗證了PP2Cs基因在其他模式植物中的ABA信號轉導途徑起著負調控的作用，表明PP2Cs在信號轉導途徑中具有相對保守的功能[22]。實時熒光定量PCR分析表明，小麥TaPP2C59基因的表達顯著受ABA、低溫和高鹽脅迫抑制。因此，可以推測TaPP2C59可能作為負調控因子參與ABA信號及非生物逆境脅迫應答[23]。脅迫處理剛毛檉柳后，ThPP2C基因在剛毛檉柳根和葉中的表達均發(fā)生了明顯改變，但時空表達模式不完全相同。表明ThPP2C基因可能參與了剛毛檉柳高鹽、干旱以及激素處理的適應過程，但其功能還有待進一步驗證[24]。

為了分析花生中PP2C基因家族的情況，利用構建的花生葉片轉錄組數(shù)據(jù)庫，通過生物信息學手段，在整個轉錄組水平上篩選蛋白磷酸酶2C家族成員，鑒定出了79個具有完整開放閱讀框PP2C基因，位于花生A組野生種的10條染色體上。將篩選到的79個花生PP2C基因，與擬南芥的PP2C基因進行了多重序列比對和系統(tǒng)進化分析，發(fā)現(xiàn)花生的PP2C基因聚到除B外的12個亞族15個亞類中，還有一些沒有聚到任何亞族中，它們可能屬于一些新的亞族。利用鹽脅迫處理前后S2和S4的20個數(shù)字表達文庫譜，篩選到35個PP2C基因受鹽脅迫誘導表達。進一步研究發(fā)現(xiàn)絕大多PP2C基因啟動子含有HSE、MBS、TC-rich repeats和ARE這些脅迫響應元件。該研究為后續(xù)通過反向遺傳手段研究花生中PP2C的功能以及利用提供了理論基礎。

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