韋 毅, 符明泰, 陽 明, 黃衛(wèi)宣, 藍 嬌, 覃喜軍, 玉 寧

(1.防城港常春生物技術開發(fā)有限公司, 防城港538038;2. 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院科研實驗中心, 南寧 530021;3. 南寧維爾凱生物技術有限公司, 南寧 530021)

食蟹猴(Macaca fascicularis)是獨具特色與優(yōu)勢的實驗動物資源, 近年來已廣泛應用于人類疾病發(fā)生機制、藥理學以及新藥臨床前安全性評價等研究領域中, 是目前國內外使用量最大的非人靈長類實驗動物[1,2]。國內有關食蟹猴血液、生化等生物學指標及正常值報道很多, 而有關正常食蟹猴的免疫功能指標的報道很少。本文對正常成年雄性食蟹猴的部分免疫功能指標進行了測定, 旨在為實驗食蟹猴的應用與免疫相關疾病的動物研究提供一些參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

原種引自越南野生食蟹猴, 經人工繁育的第3代成年雄性食蟹猴, 共36只, 體質量3.5±0.5 kg, 年齡3～5 (3.8±0.8)歲, 廣西壯族自治區(qū)防城港常春生物技術開發(fā)有限公司提供[SCXK (桂)2013-0004], 所有動物均為無外觀缺陷和行為異常, 并按相關檢驗檢疫標準確認為合格的普通級動物。飼養(yǎng)條件: 所有食蟹猴均按照野生動物飼養(yǎng)管理技術規(guī)程(LY/T, 食蟹猴), 分單籠飼養(yǎng)于不銹鋼籠具內(籠具規(guī)格90 cm×90 cm×70 cm); 溫度23℃左右; 相對濕度40%～60%;噪聲≤60 dB; 換氣次數(shù)10次/h; 明暗12 h/12 h(8∶00～20∶00); 每日飼喂猴顆粒飼料3次, 自由飲水, 并輔以清潔水果。適應性飼養(yǎng)60 d后用于實驗。

1.2 儀器設備與試劑

全自動血細胞計數(shù)儀(日本希森美康公司,XN-21)、日立7600全自動化分析儀(日本日立公司)、FACS Calibur 流式細胞儀(美國BD公司)、淋巴細胞亞群檢測試劑盒(美國Becton Dickinson 公司)、細胞因子[γ-干擾素(IFN-γ)、白介素 -2(IL-2)、白介素-5(IL-5)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、白介素-18(IL-18)]檢測試劑盒(美國BD公司)、Immage800特定蛋白儀(美國Beckman Coulter公司)。

1.3 方法

早上在動物空腹、清醒狀態(tài)下，通過籠具配套裝備固定食蟹猴，由專人每周三上午9∶00抽取動物后肢大隱靜脈血用于檢測相關指標。

1.3.1 血液學常規(guī)檢測 取抗凝血2 mL, 按照全自動血細胞計數(shù)儀以及試劑盒操作規(guī)程進行以下指標測定: 白細胞計數(shù) (WBC)、淋巴細胞計數(shù)(LY)、淋巴細胞比值 (LY%)、單核細胞計數(shù) (MONO)、單核細胞比例(MONO%)、中性粒細胞計數(shù)(NEUT)、中性粒細胞比例 (NEUT%)。

1.3.2 T淋巴細胞亞群檢測 取抗凝血2 mL與CD3-FITC、CD4-P、CD8-APC單克隆熒光抗體混勻, 避光反應15 min, 然后加入1×裂解緩沖液, 300×g離心5 min，PBS洗滌細胞，應用FACS Calibur 流式細胞儀按照CBA法進行CD3+ 、CD4+、CD8+細胞表型檢測。

1.3.3 細胞因子檢測 取血清50 μL, 應用FACS Calibur 流式細胞儀按照CBA法進行IFN-γ、白細胞介素(IL-s)包括IL-6、IL-5、IL-2、IL-10、IL-18等因子檢測。300 μL 檢測稀釋液作為陰性質控管(0 ng/L)。

1.3.4 免疫球蛋白、補體檢測 取血清500 μL，應用美國貝克曼庫爾特Immage800特定蛋白儀按照免疫散射比濁法對血清中免疫球蛋白IgG、IgA、IgM及補體C3、C4進行檢測。

1.3.5 統(tǒng)計學分析 用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布檢驗、分析，結果以x-±s表示，采用t檢驗比較組間差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 血液學指標測定

如表1所示, WBC、LY、MONO絕對值較為穩(wěn)定, 3次檢測結果間差異無統(tǒng)計學意義; 而第3周NEUT絕對值比第1周、第2周分別下降了15.24%、13.89%(P＜0.05)。

2.2 T淋巴細胞亞群指標測定

從表2中可以看出，成年食蟹猴T細胞在淋巴細胞中所占比例在第2周分別比第1周、第3周高17.86%和12.11% (P＜0.05); Tc在T細胞中所占的比例則隨檢測周次呈逐漸上升趨勢，但上升幅度較小(P＞0.05)。結果顯示正常成年雄性食蟹猴的T淋巴細胞亞群測值較為穩(wěn)定。

表1 食蟹猴血液學指標

2.3 細胞因子指標測定

如表3所示，IFN-γ、IL-10和IL-18三次檢測均未檢出; IL-5、IL-6表達量較低，3次檢測結果間差異無統(tǒng)計學意義; 而IL-2表達量較高，但三次檢測值間差異無統(tǒng)計學意義。

2.4 免疫球蛋白、補體測定

正常成年雄性食蟹猴體內的IgG呈高表達，但各相關抗體蛋白及補體均穩(wěn)定，3次檢測結果間無統(tǒng)計學意義(表4)。

表2 食蟹猴血液免疫學指標

3 討論

食蟹猴廣泛應用于免疫學、藥理學、毒理學、藥物安全性評價等方面的實驗研究。然而，目前國內關于實驗用食蟹猴的各種生物學指標仍缺乏一致性的共識，尤其在免疫功能指標檢測方面更是匱乏[3,4]。為此, 本研究結合本實驗室其他科研項目同步進行，旨在進一步補充完善該領域的實驗研究基礎數(shù)據(jù)，并建立本實驗室的相關基礎數(shù)據(jù)庫。

表3 食蟹猴血液細胞因子的表達

表4 食蟹猴免疫球蛋白、補體指標

機體免疫系統(tǒng)是一個由免疫器官、免疫細胞及免疫活性因子組成的極其復雜的網絡系統(tǒng)，通過固有性和適應性免疫應答兩種作用機制發(fā)揮免疫功能。其中，機體的適應性免疫狀況可以從體液免疫和細胞免疫兩個方面來衡量，T、B淋巴細胞分別是細胞免疫、體液免疫的主要負責細胞。本實驗成年雄性食蟹猴血液學檢測結果與國內有關報道基本一致[4]。

通過測定D4+ CD8+的比值可以對機體細胞免疫功能進行評價，其比例的高低與免疫系統(tǒng)損害的程度具有相關性[5,6]。本次檢測結果顯示，成年雄性食蟹猴T/LYM比例為(42.97±14.50～60.83±8.99)%，Th/T為(36.02±10.58～41.66±9.81)%，Tc/T為(49.64±9.23～55.35±8.10)%。其與黃秋香等[3]的研究結果部分一致。另一方面，負責體液免疫的細胞是B細胞，其通過產生特異性抗體而起作用，其中 IgG、IgA、IgM是介導體液免疫的主要效應分子，因此抗體水平是反映體液免疫狀態(tài)的重要指標。本實驗結果顯示，成年雄性食蟹猴血清中抗體蛋白IgG呈明顯高表達，與李巖等[4]的報道有一定差異，IgM的含量測定值則基本一致。

參與免疫反應的細胞因子主要有IFN、IL-s、集落刺激因子、腫瘤壞死因子和轉化生長因子等五大類[7,8]。本實驗分別對IFN-γ、IL-6、IL-5、IL-2、IL-10、IL-18等部分因子進行了檢測，結果顯示: 在正常成年雄性食蟹猴中, 未能檢出IFN-γ、IL-10、IL-18; IL-6、IL-5呈低表達; IL-2檢測結果顯示其表達量較高, 為(3.38±1.62～5.54±1.75) ng/L。所有檢測指標表達均較為穩(wěn)定，3次檢測值間無統(tǒng)計學意義。

本實驗結果顯示, 正常成年雄性食蟹猴中可檢出C3、C4補體成分，兩者表達均較為穩(wěn)定, 3次檢測值間的差異無統(tǒng)計學意義。

本實驗大部分檢測結果與文獻[9]基本一致，部分則有一定差異，這可能與動物種群、地域、環(huán)境如籠養(yǎng)方式以及實驗檢測條件等因素的影響有關。盡管本實驗樣本量較少且未進行性別年齡比對，但檢測結果顯示除血液學部分指標有所波動之外，其余指標多次測值均無顯著性差異，說明實驗重復性較好、結果較為可靠，可為食蟹猴免疫疾病模型建立、免疫疾病新藥物臨床前安全評價等相關研究工作提供免疫學方面的基礎數(shù)據(jù)參考。

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