化學發(fā)光法檢測反三碘甲狀腺原氨酸的臨床應(yīng)用評價

宋云霄， 鄔建民， 張海晨

（1.上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院檢驗科，上海 200031；2.上海市楊浦區(qū)精神衛(wèi)生中心檢驗科，上海 200093）

甲狀腺激素和甲狀腺相關(guān)抗體的檢測是輔助診斷甲狀腺疾病的主要方法之一。反三碘甲狀腺原氨酸（reverse triiodothyronine，rT3）是由甲狀腺素（thyroxine，T4）在外周組織中經(jīng)5-脫碘酶脫碘形成。rT3與三碘甲狀腺原氨酸（3，5，3'-triiodothyronine，T3）的結(jié)構(gòu)基本相同，僅是3個碘原子在3、3'、5'位。雖然rT3與T3在化學結(jié)構(gòu)上屬異構(gòu)體，但rT3幾乎無生理活性。血清中T4、T3和rT3維持在一定比例，可以反映甲狀腺激素在體內(nèi)的代謝情況[1]。rT3的生物轉(zhuǎn)化特征使其在甲狀腺功能減退（簡稱甲減）相關(guān)疾病的診療中有著重要的意義，尤其是在原發(fā)性甲減和正常甲狀腺病態(tài)綜合征（euthyroid sick syndrome，ESS）的鑒別診斷中，rT3有很高的臨床價值，可避免已罹患原發(fā)疾病，如肝臟疾病、腎臟疾病、心臟疾病、腫瘤、糖尿病等患者在甲狀腺功能異常時的非必要治療[1-3]。目前，臨床實驗室用于rT3檢測的方法主要有放射免疫法、酶免法、同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和化學發(fā)光法。放射免疫法由于方法學的局限性，對操作要求較高，試劑盒使用難度較大，檢測過程中存在安全隱患，其應(yīng)用逐漸減少[4]。酶免法由于操作時間長，不可控因素較多，導致其無法被廣泛應(yīng)用[5]。同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法由于檢測成本高、儀器昂貴、對檢測人員的要求較高等原因而無法用于大批量樣本的檢測。目前，臨床應(yīng)用較多的是化學發(fā)光法。本研究對化學發(fā)光法檢測rT3的主要分析性能進行了驗證，并初步評價了rT3在各類甲狀腺疾病患者中的臨床應(yīng)用價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2016年12月—2017年12月上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院門診或住院的符合相關(guān)疾病診斷標準[6]的各類疾病患者131例，其中甲狀腺功能亢進（簡稱甲亢）初診未治療患者30例[甲亢組，男13例，女17例，年齡（40.23±12.12）歲；包括Graves'病25例、多結(jié)節(jié)性甲狀腺腫伴甲亢2例、甲狀腺自主性高功能腺瘤2例、碘甲亢1例]、甲亢治療1個月的患者28例[甲亢治療組，男12例，女16例，年齡（42.37±14.56）歲；包括甲硫咪唑治療者15例、丙硫氧嘧啶治療者9例、131I治療者4例]、甲減初診未治療患者25例[甲減組，男10例，女15例，年齡（46.17±9.68）歲；包括原發(fā)性甲減23例、中樞性甲減2例]、甲減治療1個月的患者23例[甲減治療組，男9例，女14例，年齡（45.12±9.38）歲；均服用左甲狀腺素治療]、明確原發(fā)基礎(chǔ)疾病的患者25例[ESS組，男16例，女9例，年齡（56.17±10.58）歲；包括肝臟彌漫性損傷4例、腎臟衰竭尿毒癥期4例、心肌梗死6例、乳腺癌7例、直腸癌4例]。甲狀腺疾病及治療患者均排除高血壓、糖尿病、血脂異常、肝臟疾病、腎臟疾病及心臟疾病，且近2個月無影響激素代謝的藥物服用史。另選取上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院體檢健康者50名作為正常對照組，其中男26名、女24名，年齡（43.23±13.72）歲，均無心血管、肺、腎、肝、膽、胰等器官的器質(zhì)性疾病，甲狀腺功能檢測及甲狀腺超聲檢查無異常，隨訪6個月內(nèi)無甲狀腺相關(guān)疾病發(fā)生。

1.2 儀器與試劑

血清rT3分別采用化學發(fā)光法[CL2000i全自動化學發(fā)光免疫系統(tǒng)（深圳邁瑞公司）及配套試劑盒（批號2017120100）]和放射免疫法[SN-693型γ放射免疫計數(shù)器（上海日環(huán)公司）、125I放射免疫分析試劑盒（批號20170710C，北京北方生物技術(shù)研究所）]檢測。血清促甲狀腺激素（thyroid-stimulating hormone，TSH）、血清總T3和血清總T4采用ARCHITECT i2000化學發(fā)光免疫分析儀（美國雅培公司）及配套試劑（化學發(fā)光法）檢測。rT3免疫測定用國家標準品（批號150552-0004）購自中國食品藥品檢定研究院。

1.3 方法學評價

1.3.1 精密度評價 參照美國臨床實驗室標準化協(xié)會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP15-A3文件[7]，連續(xù)測定高、低值質(zhì)控品20次，計算變異系數(shù)（coefficient of variation，CV），以此作為批內(nèi)精密度。每天重復檢測高、低值質(zhì)控品2次，連續(xù)檢測20 d，計算CV，以此作為日間精密度。

1.3.2 正確度評價 采用rT3免疫測定用國家標準品配制低值（0.84 ng/mL）和高值（2.98 ng/mL）2個水平的樣本。參照CLSI EP15-A文件[8]，連續(xù)檢測上述樣本5 d，每天重復檢測5次。計算檢測結(jié)果與標定值之間的相對偏移。

1.3.3 分析靈敏度（最低檢測限）評價 參照《體外診斷試劑分析性能評估指導原則——檢測限》[9]，在儀器校準后，連續(xù)重復測定rT3零濃度校準品20次，得到相應(yīng)的相對發(fā)光值（relative light unit，RLU），計算均值和標準差（s）。將對應(yīng)的RLU代入主定標曲線方程中，得到最低檢測限。

1.3.4 分析特異性評價 （1）類似物干擾實驗：準備不含rT3的零值樣本，向樣本中分別添加類似物（T3、T4、三碘甲狀腺素乙酸、3，5-二碘甲狀腺素、3，5-二碘酪氨酸、T3鈉鹽、3-碘酪氨酸），制備干擾樣本。檢測干擾樣本中的rT3水平，計算交叉反應(yīng)率（交叉反應(yīng)率=樣本均值/類似物水平×100%）。（2）血清內(nèi)源性干擾物干擾實驗：根據(jù)CLSI EP7-A2文件[10]，通過添加不同量的rT3標準品，配置高、低水平的血清樣本，此為基礎(chǔ)樣本。準確稱取干擾物質(zhì)，配置干擾物母液，按廠商試劑說明書中聲明的最高干擾物濃度（甘油三酯20 mg/mL、膽紅素200 mg/L、血紅蛋白1 000 mg/L、白蛋白100 g/L）向基礎(chǔ)樣本中加入干擾物，此為干擾樣本。分別檢測基礎(chǔ)樣本和干擾樣本中的rT3水平，計算二者的相對偏差[相對偏差=（干擾樣本-基礎(chǔ)樣本）/基礎(chǔ)樣本×100%]。

1.3.5 線性范圍評價 取1份接近預(yù)期上限的混合血清樣本（H），測定rT3水平。采用原裝樣本稀釋液（L），按體積比5L、4L∶1H、3L∶2H、2L∶3H、1L∶4H、5H配制成6個水平的系列樣本，每份樣本測定2次，取預(yù)期值（X）計算公式：X=（CL×VL+CH×VH）/（VL+VH），式中C為濃度，V為體積。按CLSI EP6-A文件[11]提供的方案初步檢查數(shù)據(jù)、離群值，判斷重復性，之后進行多元線性回歸分析，將結(jié)果分別擬合一次、二次、三次多項式，并繪制散點圖。

1.3.6 參考區(qū)間驗證 在正常對照者中隨機抽取20名，男、女各10名，年齡18～48歲。在檢測系統(tǒng)質(zhì)控在控的情況下檢測rT3，根據(jù)公式計算樣本的陽性率，進行參考區(qū)間的驗證。陽性樣本率=（高于參考區(qū)間上限的例數(shù)+低于參考區(qū)間下限的例數(shù)）/總樣本數(shù)×100%。

1.3.7 方法學比對 根據(jù)CLSI EP9-A3文件[12]，同時采用化學發(fā)光法和放射免疫法分別隨機檢測70份血清樣本，以放射免疫法（比較方法）的檢測結(jié)果為橫坐標，以化學發(fā)光法（實驗方法）的檢測結(jié)果為縱坐標，繪制散點圖，明確實驗方法和比較方法之間的相關(guān)性，若所得結(jié)果線性良好，比較二者檢測數(shù)據(jù)，得回歸方程Y= aX+ b，計算r值。

1.3.8 臨床應(yīng)用評價 分別檢測甲亢組、甲亢治療組、甲減組、甲減治療組、ESS組和正常對照組的甲狀腺功能相關(guān)指標（TSH、T3、T4及rT3），比較不同甲狀腺疾病患者的甲狀腺激素檢測結(jié)果及rT3輔助診斷ESS的價值。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用Microsoft Excel 2013及SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。對檢測數(shù)據(jù)進行K-S正態(tài)性檢驗，呈正態(tài)分布的計量資料以呈正態(tài)分布的計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析及q檢驗。兩變量間的相關(guān)性采用Pearson線性相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 精密度評價

化學發(fā)光法檢測rT3高值和低值質(zhì)控品的批內(nèi)精密度（CV）分別為4.82%和4.95%，批間精密度（CV）分別為7.51%和5.90%，均低于廠商聲明的CV（≤10%）。見表1。

表1 精密度評價

2.2 正確度評價

高值和低值樣本的相對偏移分別為-1%和1%，均在可接受標準（相對偏差≤±10%）之內(nèi)。見表2。

表2 正確度評價結(jié)果

2.3 分析靈敏度（最低檢測限）評價

rT3零濃度校準品的RLU的為 2 507 565.00，s為84 664.30，CV為3.38%，的值為2 676 894.00，對應(yīng)的rT3水平為0.05 ng/mL。最低檢測限在可接受標準（≤0.05 ng/mL）之內(nèi)。

2.4 分析特異性評價

類似物檢測所得的交叉反應(yīng)率分別為T30.2‰、T40.6‰、三碘甲狀腺素乙酸 0.5‰、3，5-二碘甲狀腺素 0.5‰、3，5-二碘酪氨酸0.8‰、T3鈉鹽 0.4‰、3-碘酪氨酸 0.2‰。所選類似物的交叉反應(yīng)率均在可接受范圍（≤1‰）內(nèi)；檢測內(nèi)源性干擾物的檢測偏差均在可接受范圍內(nèi)（相對偏差≤±10%）。

2.5 線性范圍評價

預(yù)期值和實測值均無離群值，最佳擬合方程為一次多項式，回歸方程為Y=1.008X+0.153（r=0.999）。6個水平的樣本相對偏移的絕對值為0%～7.9%，平均偏移為4.17%。以10%作為相對偏移的判斷標準，化學發(fā)光法測定rT3在0.05～10.07 ng/mL范圍內(nèi)呈線性，與廠商聲明的線性范圍（0.05～10.00 ng/mL）基本一致。

2.6 參考區(qū)間驗證

20名正常對照者的rT3檢測結(jié)果均在廠商聲明的參考區(qū)間（0.20～0.95 ng/mL）內(nèi)，樣本陽性率為0%，符合參考區(qū)間驗證的可接受標準（陽性率≤10%）。參考區(qū)間驗證通過。

2.7 方法學比對

以化學發(fā)光法為實驗方法（Y），放射免疫法為比較方法（X），得回歸方程為Y=1.055X-0.370（r=0.952）。化學發(fā)光法與放射免疫法相關(guān)性良好。見圖1。

圖1 化學發(fā)光法與放射免疫法檢測rT3的相關(guān)性分析

2.8 rT3的臨床應(yīng)用評價

2.8.1 不同甲狀腺疾病患者的rT3水平比較與正常對照組比較，甲亢組rT3、T3、T4水平明顯升高（P＜0.05），TSH水平明顯降低（P＜0.05）。與甲亢組比較，甲亢治療組rT3、T3、T4水平明顯降低（P＜0.05），TSH水平明顯升高（P＜0.05），rT3降低的程度低于T3、T4。與正常對照組比較，甲減組T4和rT3水平明顯降低（P＜0.05），TSH水平明顯升高（P＜0.05）。與甲減組比較，甲減治療組rT3、T4水平明顯升高（P＜0.05），TSH水平明顯降低（P＜0.05），T3和T4均有不同程度上升。甲亢組和甲減組rT3水平變化與T3、T4水平的變化平行。見表3。

2.8.2 rT3的鑒別診斷價值 ESS組rT3水平明顯高于甲減組和正常對照組（P＜0.05），T3和T4水平明顯低于正常對照組（P＜0.05），但與甲減組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），TSH水平明顯低于甲減組（P＜0.05），但與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4。

表3 甲狀腺疾病相關(guān)甲狀腺激素的檢測結(jié)果

表3 甲狀腺疾病相關(guān)甲狀腺激素的檢測結(jié)果

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與甲亢組比較，#P＜0.05；與甲減組比較，△P＜0.05

組別 例數(shù) T3（nmol/L） T4（nmol/L） rT3（ng/mL） TSH（μIU/L）甲亢組 30 10.27±5.48* 398.23±121.54* 1.57±0.76* 6.40±4.50*甲亢治療組 28 5.23±2.31# 212.21±35.78# 1.22±0.32# 14.20±11.20甲減組 25 0.65±0.23 45.65±10.32* 0.29±0.11* 352.30±225.90*甲減治療組 23 1.98±1.01 68.34±15.23 0.42±0.17 52.40±44.70△正常對照組 50 1.51±0.37 100.94±20.32 0.55±0.10 24.10±13.30

表4 甲減組與ESS組甲狀腺激素檢測結(jié)果的比較

表4 甲減組與ESS組甲狀腺激素檢測結(jié)果的比較

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與甲減組比較，#P＜0.05

組別 例數(shù) T3（nmol/L） T4（nmol/L） rT3（ng/mL） TSH（μIU/L）ESS組 25 0.83±0.18 58.39±9.23* 0.93±0.23*# 32.70±14.60甲減組 25 0.65±0.23 45.65±10.32* 0.29±0.11* 352.30±225.90*正常對照組 50 1.51±0.37 100.94±20.32 0.55±0.10 24.10±13.30

3 討論

目前，血清rT3被認為是可有效鑒別原發(fā)性甲減和ESS的項目，且有研究結(jié)果表明，其水平與T3/rT3比值一樣，可用于評估某些疾病的預(yù)后[13-15]。因此，rT3的檢測越來越普遍。本研究采用的化學發(fā)光法檢測rT3的原理是競爭化學發(fā)光免疫分析，即待測物中的游離rT3與rT3抗體-堿性磷酸酶結(jié)合成復合物后，生物素化的rT3和鏈霉親和素磁珠競爭性結(jié)合rT3抗體-堿性磷酸酶，在化學發(fā)光底物的作用下，根據(jù)產(chǎn)生的光子數(shù)計算待測物中rT3的水平。該法特異性強，光信號持續(xù)時間長且穩(wěn)定，易于測定，大大提升了檢測敏感性。本研究根據(jù)相關(guān)標準文件的要求，對化學發(fā)光法檢測rT3的方法學性能進行了驗證。結(jié)果顯示化學發(fā)光法的精密度、準確度、分析特異性、線性范圍等性能指標均符合臨床應(yīng)用要求。化學發(fā)光法的線性范圍的上限為10 ng/mL，而放射免疫法的線性范圍上限僅為3.2 ng/mL。分析特異性評價結(jié)果顯示內(nèi)源性干擾物（T3、T4、三碘甲狀腺素乙酸、3，5-二碘甲狀腺素、3，5-二碘酪氨酸、T3鈉鹽、3-碘酪氨酸）造成的檢測偏差均在可接受范圍內(nèi)。方法學比對結(jié)果顯示化學發(fā)光法與放射免疫法的相關(guān)性良好（r=0.952）。由圖1可見，當rT3水平較高時，放射免疫法的檢測結(jié)果普遍高于化學發(fā)光法。原因可能與2種方法使用的標準品不同有關(guān)。有研究結(jié)果表明，標準品對檢測結(jié)果的影響較大；另外，放射免疫法對放射性精準度的要求較高，微小、過量或不足均會導致檢測結(jié)果出現(xiàn)較大差異[3，14，16]。

本研究結(jié)果顯示，甲亢組rT3、T3、T4水平明顯升高（P＜0.05），rT3升高的程度與T3、T4一致。ESS組rT3水平明顯高于甲減組及正常對照組（P＜0.05），這一結(jié)果與其他研究相符。ESS非甲狀腺本身病變，而是由于嚴重疾病或饑餓等狀態(tài)導致循環(huán)甲狀腺激素水平降低，是機體的一種保護反應(yīng)[17]。有研究結(jié)果表明，在心肌梗死、呼吸衰竭、卒中等急重癥患者中，rT3也可用于預(yù)后評價[18]。目前，在我國相關(guān)臨床指南中，不建議用甲狀腺激素替代治療，認為激素療法反而會帶來不良反應(yīng)[19]。

綜上所述，化學發(fā)光法檢測rT3具有良好的精密度、準確度和特異性，線性范圍較寬，適用于臨床大規(guī)模樣本的檢測。rT3在甲狀腺相關(guān)疾病的診斷、鑒別診斷和臨床用藥指導中具有重要作用。

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