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(1.西南林業(yè)大學(xué)西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，　云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué)云南省高校林木遺傳改良與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，　云南 昆明 650224)

白及(Bletillastriata)又名白芨，是研究較多、應(yīng)用較廣的一味中藥[1]。為蘭科(Orchidaceae)白及屬(Bletilla)多年生植物[2]。在我國的云南、貴州、四川、廣西、陜西、安徽等地均有分布。白及以干燥塊莖藥用，具有較高的藥用價(jià)值[3-4]。其提取物用于肝癌栓塞的治療，化療的嘔吐治療等均取得了顯著療效，其用于多種腫瘤的治療前景廣闊[5]。此外，以白及為主要原料開發(fā)的面膜，具有較高美容功能和特別美容療效[6]。

蘭科植物種子呈粉末狀，種皮由一層透明的薄壁細(xì)胞組成，種皮內(nèi)為一細(xì)小的圓形或橢圓形胚, 無胚乳，自然條件下極難萌發(fā)[7]。一般采用種子與真菌在共同的環(huán)境中培養(yǎng)，從而達(dá)到促進(jìn)蘭科植物種子萌發(fā)的目的[8]；白及作為蘭科植物中的一員，自然條件下萌發(fā)同樣困難，其成熟的種子呈橄欖形，種皮為單層細(xì)胞組成[9]。白及種子的萌發(fā)率與其胚齡及有胚率呈正相關(guān), 萌發(fā)時(shí)間則與胚齡及有胚率呈負(fù)相關(guān)[10]；以胚齡為20周后采收的種子最好，有胚率最高，萌發(fā)率為100%[11]。種子采收后，5 ℃條件下是白及鮮果的最佳貯藏溫度，而采用冷凍和常溫條件進(jìn)行保存，均不利于白及種子生活力的保持[12]。當(dāng)前，白及的種苗生產(chǎn)主要采用植物組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行繁殖，此外，也可采用塊莖進(jìn)行繁殖，但繁殖系數(shù)低，而傳統(tǒng)分株繁殖也還未取得任何關(guān)鍵性的突破[13-14]。而采用白及種子進(jìn)行播種直播育苗，目前僅有零星報(bào)道[9,15-17]。激素催芽對白及種子催芽的效果如何、萌發(fā)是否必需共生菌的參與、萌發(fā)后對水分的適應(yīng)能力，這些都是影響白及種子直播成苗的關(guān)鍵因素。試驗(yàn)圍繞影響白及直播成苗的主要因素進(jìn)行了試驗(yàn)探索，從而完善白及直播育苗技術(shù)體系，也為其它類似的蘭科植物種子直播育苗提供借鑒。

1　材料與方法

1.1　材　料

實(shí)驗(yàn)材料為三叉白及的成熟蒴果，采于云南省個(gè)舊市。

1.2　方　法

1.2.1白及種子質(zhì)量的檢測

種子的生活力檢測常采用TTC染色法進(jìn)行測定，本次試驗(yàn)則借助前期篩選的無菌萌發(fā)培養(yǎng)基對試驗(yàn)種子進(jìn)行無菌萌發(fā)觀察，所用的萌發(fā)培養(yǎng)基為1/2 MS+6-BA 1.0+NAA 0.1。在進(jìn)行白及種子直播過程中，分別對新鮮種子、常溫下貯藏3個(gè)月和6個(gè)月的種子進(jìn)行發(fā)芽率測定，以檢查試驗(yàn)過程中所用種子的萌發(fā)能力，從而排除試驗(yàn)中種子未能萌發(fā)的自身原因。用于直播試驗(yàn)的種子均為多個(gè)果莢混合后取樣，每個(gè)處理各5瓶。種子播種數(shù)量控制在200粒左右，下同。

1.2.2不同濃度的奈乙酸、吲哚乙酸對白及種子萌發(fā)的影響

在前期預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)之上，選用奈乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)為白及種子催芽的激素，濃度分別為0.1，0.3，0.5，1.0 mg/L等4個(gè)水平梯度，以未添加激素處理的蒸餾水為對照，共9個(gè)處理，每處理重復(fù)3次。浸泡催芽1 h后，分別將種子置于培養(yǎng)皿中的濾紙上，培養(yǎng)皿中保持濕潤，置于25 ℃條件下的培養(yǎng)室內(nèi)，定期補(bǔ)充水分。種子萌發(fā)后，記錄種子每天的萌發(fā)數(shù)量，計(jì)算發(fā)芽率和發(fā)芽勢。

1.2.3不同基質(zhì)處理對白及種子萌發(fā)的影響

在大田直播育苗前，為了進(jìn)一步掌握白及種子在基質(zhì)中的萌發(fā)能力，以紅土∶腐殖土=1∶1為直播育苗的基質(zhì)，比較不同處理下的基質(zhì)對白及種子的萌發(fā)情況。首先，將配比好的基質(zhì)設(shè)置成2種含水率狀態(tài)，即基質(zhì)剛好濕潤下的土壤含水率和土壤水分嚴(yán)重飽和狀態(tài)下的含水率，分別用于模擬正常水分管理和澆水過量下的狀態(tài)，并對含水率進(jìn)行測定，之后再以正常含水率的基質(zhì)分別進(jìn)行滅菌和不滅菌處理(見表1)。并將處理好的基質(zhì)分別放入組培瓶中，其厚度為3～4 cm，每個(gè)處理3次重復(fù)。最后將催芽的白及種子直接播撒于以下3種不同處理的組合中，于培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)觀察。

表1不同基質(zhì)處理的方案設(shè)計(jì)

處理組合基質(zhì)是否高壓滅菌基質(zhì)含水率(%)1是65.42否65.43否133.9

1.2.4白及種子直播育苗試驗(yàn)

基于以上試驗(yàn)結(jié)果，初步掌握白及種子的萌發(fā)特性后，在大棚內(nèi)進(jìn)行白及種子的直播育苗。育苗基質(zhì)同上，播種前采用多菌靈對苗床進(jìn)行消毒處理。白及種子催芽后進(jìn)行播種，用塑料膜保濕，并定期澆水，以驗(yàn)證以上的試驗(yàn)結(jié)果。

2　結(jié)果與分析

2.1　白及種子的無菌萌發(fā)結(jié)果

通過無菌培養(yǎng)基上的萌發(fā)結(jié)果可以看出，新鮮的白及種子萌發(fā)率最高，無菌萌發(fā)率達(dá)到了98.17%。在昆明的常溫條件下貯藏6個(gè)月后，其在培養(yǎng)基中的無菌萌發(fā)率仍達(dá)87.1%。試驗(yàn)結(jié)果(表2)表明，本次試驗(yàn)所用白及種子具有較高的萌發(fā)率。在試驗(yàn)過程中，如果任何一個(gè)處理下的種子不能萌發(fā)，則完全可以排除種子無發(fā)芽能力的問題。此外，對于新采集的白及種子，如需用于次年春季直播育苗，采用常溫貯存方式即可。

表2貯藏時(shí)間對白及種子萌發(fā)的影響

貯藏時(shí)間(月)萌發(fā)率(%)098.17±1.31a388.70±1.41b687.10±3.42b

注：同列中不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。下同。

2.2　不同生長素種類和濃度對白及種子萌發(fā)的影響

由表3可以看出，不同濃度處理的NAA、IAA對白及種子的萌發(fā)率、發(fā)芽勢存在著顯著差異，特別是2種激素的催芽處理，其效果顯著優(yōu)于對照，表明激素催芽可以促進(jìn)白及種子的萌發(fā)。此外，從不同激素處理對種子的發(fā)芽率結(jié)果來看，處理2的發(fā)芽率最高，但是與處理1、處理2、處理3、處理4、處理5、處理6間均無差異。結(jié)合發(fā)芽勢來進(jìn)行分析，在以上發(fā)芽率無差異的6個(gè)處理中，處理3的發(fā)芽勢與其他5組處理均存在差異顯著。發(fā)勢芽是評判種子發(fā)芽能力優(yōu)劣的一個(gè)重要指標(biāo)，在發(fā)芽率相同的情況下，以種子發(fā)芽勢高的處理效果最好。因此，對以上結(jié)果進(jìn)行綜合分析得出，處理3(0.5 mg/L NAA)對白及種子的催芽萌發(fā)效果最佳。

表3不同NAA或IAA濃度處理對白及種子萌發(fā)的影響

編號NAA(mg/L)IAA(mg/L)萌發(fā)率(%)發(fā)芽勢(%)10.189.68±0.58 a23.76±1.25e20.390.26±0.85a55.71±0.77b30.589.27±1.34ab63.31±2.08a41.087.16±1.15ab58.71±2.05b50.186.58±0.88ab24.30±0.43e60.386.97±1.09ab44.65±0.57d70.584.90±0.72b49.51±0.56c81.084.45±1.07b22.92±1.11e90044.96±1.99c14.65±3.26f

2.3　基質(zhì)不同處理對白及種子萌發(fā)的影響

從圖1可以看出，白及種子在3種不同處理下的基質(zhì)中均能正常萌發(fā)，表明白及種子是一類較易萌發(fā)的種子。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，不論基質(zhì)是否高壓滅菌消毒，白及種子均能正常萌發(fā)，說明白及種子萌發(fā)過程中不需要共生菌的參與。白及種子在高壓滅菌的基質(zhì)中萌發(fā)速度和萌發(fā)效果均要優(yōu)于未高壓滅菌的基質(zhì)，這可能是由于白及種子在無菌基質(zhì)中萌發(fā)，沒有土壤微生物的侵?jǐn)_，其萌發(fā)環(huán)境較為有利，但是在后期生長過程中，基質(zhì)中逐漸產(chǎn)生真菌，最終導(dǎo)致萌發(fā)后的白及小苗死亡。而未作高壓滅菌處理的基質(zhì)，白及則可以正常生長，其主要原因尚不清楚。而對于2種含水率的基質(zhì)，白及種子萌發(fā)的影響存在一定的差別，從圖1可以看出，高水率的基質(zhì)，不利于白及種子的萌發(fā)，此外，長期處于高含水量的基質(zhì)中，使得存活的白及小苗均呈現(xiàn)出水浸狀。從這個(gè)極端的結(jié)果可以得出，白及種子在萌發(fā)過程中，對水分的適應(yīng)能力較強(qiáng)，植株雖然呈現(xiàn)異常，但并未導(dǎo)致植株全部死亡。說明白及種子的萌發(fā)不需要共生菌的參與，而萌發(fā)的白及小苗后期在生長過程中是否與土壤中的微生物產(chǎn)生共生關(guān)系則仍需要通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；同時(shí)白及種子對土壤高含水量的基質(zhì)具有一定的適應(yīng)能力。

注：a為處理1中的白及種子萌發(fā)效果(75 d)；b為處理1的白及種子萌發(fā)效果(100 d)；c為處理2的白及種子萌發(fā)效果(55 d)；d為處理2的白及種子萌發(fā)效果(100 d)；e為處理3的白及種子萌發(fā)效果(55 d)；f為處理3的白及種子萌發(fā)效果(100 d)。圖1　基質(zhì)不同處理下的白及種子萌發(fā)效果

圖2　直播180 d的白及苗

2.4　白及種子直播苗的培育

基于以上試驗(yàn)結(jié)果，開展了白及種子大棚直播育苗試驗(yàn)。首先對白及種子進(jìn)行催芽處理，之后再進(jìn)行撒播。在大棚的直播育苗過程中，種子直播所用苗床為大棚內(nèi)現(xiàn)有紅土，深翻土壤，拌入少量腐殖土。待催芽后的種子大部分萌發(fā)后，直播種于準(zhǔn)備好的苗床上。保持土壤濕潤，保持溫度在20～30 ℃之間，并注意保持空氣濕度。白及種子于4月中旬播種，播種4個(gè)月后白及小苗達(dá)到測定要求，對其進(jìn)行生長調(diào)查，其生長情況分別見表4和圖2。

3　討　論

合適的溫度、充足的水分、足夠的氧氣是種子萌發(fā)的3個(gè)基本條件，但是有些植物的種子即使?jié)M足以上3個(gè)條件，也不能正常萌發(fā)。其主要原因是種子的萌發(fā)和休眠受多種因素控制，包括植物激素[18]、一些化感物質(zhì)[19]，如蘭科植物天麻的種子需要有共生菌的參與才能萌發(fā)[20]。白及種子在野外自然條件下極難萌發(fā)成苗，而通過植物組織培養(yǎng)進(jìn)行無菌萌發(fā)是相對容易，技術(shù)十分成熟。白及種子的無菌萌發(fā)過程，一般經(jīng)過種胚、原球莖、根狀莖和假鱗莖4個(gè)階段[21]。本次試驗(yàn)結(jié)果表明，采用NAA或IAA進(jìn)行催芽處理，均能促進(jìn)白及種子的萌發(fā)，此外，種子在沒有共生菌的情況下也能正常萌發(fā)，這與已經(jīng)報(bào)道文獻(xiàn)結(jié)果較為相似[16-17]。在試驗(yàn)過程中也發(fā)現(xiàn)，在組培瓶內(nèi)進(jìn)行直播的白及種子，萌發(fā)后的生長速度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于室外大棚中直播的白及苗。原因可能是大棚是一個(gè)較為開放的環(huán)境，萌發(fā)后的白及小苗能夠在后期的生長過程中，逐漸形成一個(gè)新的微生物共生系統(tǒng)，從而有助于營養(yǎng)的吸收。這或許就是野外生長的白及植株均能分離出較多共生菌的原因[22]。

白及作為蘭科植物中相對較易萌發(fā)的種子，可作為研究蘭科植物種子直播成苗的模式植物。對于白及種子的萌發(fā)，滿足種子萌發(fā)的3個(gè)基本條件即可正常萌發(fā)。雖然白及種子萌發(fā)時(shí)沒有胚乳提供營養(yǎng)，但是其胚的大型薄壁細(xì)胞中富含有淀粉及脂類等貯藏物質(zhì)，能夠保證種子在常規(guī)條件下萌發(fā)的營養(yǎng)需求[9]。這也是白及能夠直播成苗的關(guān)鍵因素之一，但是萌發(fā)后的白及，后期管護(hù)同樣尤為重要，其關(guān)鍵是要控制好土壤水分和空氣濕度，萌發(fā)過程中極易失水死亡。本次試驗(yàn)比較了水分、基質(zhì)是否高壓滅菌、以及激素是否處理對白及萌發(fā)效果的一個(gè)初步評價(jià)，而對于萌發(fā)過程，采用何種化學(xué)物質(zhì)處理來提高其抗逆性，何種基質(zhì)配比最有利于白及小苗生長，以及萌發(fā)后的白及小苗如何與土壤微生物形成一個(gè)緊密的共生關(guān)系仍需要進(jìn)一步的研究。

表4白及種子直播苗生長動(dòng)態(tài)變化

測定日期(年/月/日)葉鞘(cm)株高(cm)葉片數(shù)(片)2016/08/160.42±0.092.28±0.602～32016/08/300.73±0.294.09±1.302～32016/09/171.57±0.416.73±1.282～32016/09/301.65±0.397.29±1.212～32016/10/151.83±0.397.93±1.182～32016/10/301.97±0.468.35±1.293～42016/11/142.02±0.458.51±1.213～42016/11/302.04±0.468.58±1.253～42016/12/162.13±0.458.68±1.283～42016/12/292.15±0.448.74±1.273～4

4　結(jié)　論

采用NAA或IAA對白及種子進(jìn)行催芽處理，均能促進(jìn)其種子的萌發(fā)，且在0.5mg/L的NAA處理下，白及種子的萌發(fā)效果最好，萌發(fā)率為89.27%，發(fā)芽勢為63.21%。白及種子的直播過程中，在沒有共生菌的情況下也可正常萌發(fā)。此外，白及種子萌發(fā)過程中對基質(zhì)的高含水率適應(yīng)能力較強(qiáng)。直播育苗過程中除催芽處理外，后期則需注意控制好溫濕度。