張飛，高秀清，劉寶玲，張靖潔，薛金愛，張紅梅*，李潤植*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西 太谷 030801)

大豆(Glycinemax)是我國和世界主要糧油作物之一，其蛋白質(zhì)含量高，氨基酸種類多，鈣磷鐵含量豐富，脂肪含量高。大豆油除了作為人類食用油的主要來源之外，還用于生物柴油生產(chǎn)、食品和油脂化工業(yè)等[1]。大豆油的市場消費(fèi)量逐年增長[2]，培育高油大豆品種尤為重要。因大豆種子油含量與蛋白含量呈負(fù)相關(guān),常規(guī)育種手段難以克服，不易培育獲得蛋白質(zhì)和油脂含量雙高的新品種。

二?；视王；D(zhuǎn)移酶(Diacylgycerol acyltransferase，DGAT)是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細(xì)胞微粒體酶，它能夠催化二酰甘油加上脂肪酸?；扇８视停侨８视秃铣傻南匏倜?。根據(jù)DGAT的結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位等的差異將其分為4種類型: DGAT1、DGAT2、WS /DGAT和胞質(zhì)內(nèi)DGAT (Cyto DGAT)。DGAT1屬于?；o酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶家族(acyl CoA: cholesterol acyltransferase，ACAT)，而DGAT2則屬于DGAT2超家族[3,4]，DGAT1和DGAT2蛋白主要結(jié)合在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，屬微粒體酶。WS /DGAT和Cyto DGAT是近年發(fā)現(xiàn)的新類型，目前研究較少。研究表明，DGAT1在高等植物種子TAG形成中發(fā)揮重要作用。DGAT1在大豆的幼根、莖、葉子、花和幼嫩種子等器官中均有表達(dá)，并且具有時空性，超表達(dá)二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶DGAT1，能增加三酰甘油的含量，進(jìn)而增加大豆種子的出油率。

Jako等研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥DGAT1突變體AS11中種子含油量下降20%～40%，而過量表達(dá)擬南芥AtDGAT1，轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的DGAT活性比野生型提高10%～70%，并且提高了種子含油量和種子的千粒重[5]。Zheng等發(fā)現(xiàn)表達(dá)普通玉米DGAT1基因的玉米種子含油量、胚含油量和油酸含量分別提高了9.3%、12.4%和40.5%； 而表達(dá)高油玉米DGAT1基因的玉米種子含油量、胚含油量和油酸含量分別提高27.9%、26.1%和84.5%[6]。Zhang等使煙草DGAT1基因沉默后，引起煙草種子油含量減少9%～49%[7]。劉正杰等發(fā)現(xiàn)陸地棉內(nèi)源基因GhDGAT1沉默后轉(zhuǎn)基因種子中GhDGAT1基因表達(dá)量顯著降低,種仁含油量下降,下降幅度達(dá)3.13%[8]。Lardizabal等在大豆種子中過表達(dá)真菌DGAT2基因，使大豆種子的總含油量提高了1.5%[9]。這說明DGAT1確實(shí)在油脂合成累積過程中起關(guān)鍵作用。研究表明，斑鳩菊二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶VgDGAT1A在發(fā)育種子中高量表達(dá)[10]。異源超表達(dá)VgDGAT1使亞麻薺種子含油量從野生型的37%提高到46%～51%[11]。VgDGAT1可以顯著的提高棉花種子的含油量18%～40%[12]。由此可知，VgDGAT1A的異源表達(dá)能夠有效增加種子內(nèi)的脂肪酸含量，是一個優(yōu)異的提高含油量的靶基因。

本試驗在前期培育獲得的VgDGAT1A轉(zhuǎn)基因大豆材料基礎(chǔ)上，重點(diǎn)對高代轉(zhuǎn)基因大豆材料進(jìn)行表型分析，通過實(shí)時熒光定量PCR檢測VgDGAT1A基因在這些高代大豆材料中表達(dá)情況。取成熟的轉(zhuǎn)基因大豆種子進(jìn)行總脂肪酸提取，分析VgDGAT1A對種子總油脂含量及其他表型的影響，鑒定獲得含油量平均提高5.1%的高油大豆品系。本研究為全面理解大豆油脂合成積累機(jī)制及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了新知識，亦為改良高油大豆品種提供可靠的理論與種質(zhì)資源。

1　材料與方法

1.1　材料

本試驗轉(zhuǎn)基因大豆的二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT1A)基因從斑鳩菊發(fā)育種子中克隆所得。本試驗所檢測的轉(zhuǎn)基因大豆高代材料(種子特異表達(dá)VgDGAT1A)由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所培育保存。轉(zhuǎn)VgDGAT1A基因大豆種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作站網(wǎng)室，待植株長至4周齡(4～6片真葉)，取頂端葉片迅速放于液氮中冷凍，然后冷凍保存，以待陽性植株實(shí)驗。在陽性植株生長后期，取開花后(day after flowering，DFA)30天(30 d)大豆種子經(jīng)液氮處理后，存于-80 ℃冰箱保存用于定量表達(dá)分析，取大豆成熟種子用于提取油脂。

1.2　轉(zhuǎn)VgDGAT1A基因大豆陽性植株檢測

本文以4周齡的大豆幼苗(4～6片真葉)為試驗對象，采取改良版的CTAB法提取葉片DNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測外源VgDGAT1A基因。用primer5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計引物(表1)，設(shè)計時應(yīng)避免引物二聚體的出現(xiàn)，引物由TSINGKE Biological Technology公司合成。用2×Taq PCR StarMix with Loading Dye試劑盒(Genstar公司)進(jìn)行PCR檢測(反應(yīng)體系共20 μL，正向和反向引物各1 μL(表1中VgDGAT1A引物，10 nmol·L-1)，10 μL 2×Taq PCR StarMix混合，1 μL DNA(100 μg·mL-1)，7 μL ddH2O，反應(yīng)在96孔板內(nèi)進(jìn)行)。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃ 2min，94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)，然后利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1陽性VgDGAT1A植株檢測及其qRT-PCR引物

Table1Primers of qRT-PCR of assays in positiveVgDGAT1A-transgnicsoybeans

引物Primer序列/5’→3’VgDGAT1A-FTGCGACTCATACAGGATTCAACVgDGAT1A-RAAATGTGTCCCTTGGGTTTGTqRT-PCR-FCCACTTGCTGCCTACATTqRT-PCR-RCGAGACGCCTGATAGAACGmActin-FAAGCTGTTCTCTCCTTGTACGCCGmActin-RGCACAGTGTGAGACACACCATCA

1.3　VgDGAT1A在轉(zhuǎn)基因大豆中的異源表達(dá)分析

本試驗使用Total RNA Extractor試劑盒(BBI Life Science公司)提取總RNA。取大豆種子中期進(jìn)行取樣，在液氮中充分研磨，然后進(jìn)行總RNA的提取。將所得到的RNA溶液置于-80 ℃保存。使用cDNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Genstar公司)獲得cDNA。用2×增強(qiáng)型染料實(shí)時熒光定量PCR 預(yù)混液(GenStar公司)進(jìn)行qRT-PCR(反應(yīng)體系共50 μL，正向和反向引物各1 μL(表1中qRT-PCR引物，10 nmol·L-1)，25 μL 2×RealStar Green Power Mixture混合，1 μL cDNA(100 μg·mL-1)，1 μL ROX Reference Dye(50×)，21 μL RNase-free H2O，反應(yīng)在96孔板內(nèi)進(jìn)行)。內(nèi)參引物見表1中GmActin。反應(yīng)程序為：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，59 ℃ 1min，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。以大豆管家基因Actin做內(nèi)參，采用2-ΔΔCq來計算目的基因相對表達(dá)水平。

1.4　大豆總脂肪酸提取

利用分析天平分別準(zhǔn)確稱取50 mg粗研的野生型大豆Jack和轉(zhuǎn)基因大豆種子粉末，加入石英砂后充分研磨，研磨后置于50 mL離心管中，加入7.5 mL甲醇∶氯仿(2∶1)溶液，置于37 ℃的搖床抽提24 h，離心后收集上層有機(jī)相，剩余的樣品殘渣再加入7.5 mL甲醇∶氯仿(2∶1)溶液重復(fù)抽提12 h并離心收集上層有機(jī)相，同理進(jìn)行第3次抽提后合并3次的有機(jī)相。加入5 mL氯仿，9 mL 1%的NaCl溶液，使得最后甲醇∶氯仿∶H2O為2∶2∶1.8，混勻后8 000 r·min-1離心10 min，收集下層有機(jī)相到稱重的玻璃管中，氮?dú)獯蹈珊蠓Q出玻璃管及脂肪酸的總重量。每個樣品3次重復(fù)。計算方法：總脂含量=(提取后總重-提取前管重)/0.05。

2　結(jié)果與分析

2.1　轉(zhuǎn)VgDGAT1A基因大豆陽性植株的檢測

以大豆核基因組DNA為模板，PCR檢測轉(zhuǎn)VgDGAT1A基因的陽性大豆植株，凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物(圖1)，在第5代材料中，共檢測大豆植株2 000株，檢測出陽性植株有1 578株，檢測通過率78.9%，后續(xù)實(shí)驗選用檢測出的VgDGAT1A穩(wěn)定整合的第6或第7陽性大豆品系。

圖1　VgDGAT1A轉(zhuǎn)基因大豆PCR檢測。Fig.1　The PCR test for VgDGAIT DNA in the transgenic soybeans注：VgDGAT1A基因片段是1 828 bp，圖中“+”為陽性質(zhì)粒上的目的基因，“-”代表非轉(zhuǎn)基因野生大豆，圖中“1～22”代表轉(zhuǎn)基因植株Note:The PCR amplification fragment of VgDGAT1A is 1 828 bp. "+" represents target fragment from positive plasmid, "-" represents wild soybean, "1～22" represents transgenic soybean plants

2.2　VgDGAT1A在大豆種子中的表達(dá)分析

檢測發(fā)育種子總RNA提取質(zhì)量顯示，A260/280范圍在1.97～2.01，條帶分明，沒有明顯的彌散帶，質(zhì)量好，可以用于后續(xù)cDNA第一鏈合成及qRT-PCR試驗。以野生型大豆Jack為對照，對轉(zhuǎn)VgDGAT1A基因大豆種子發(fā)育中期階段樣品進(jìn)行熒光定量檢測(圖2)。比較發(fā)現(xiàn)，VgDGAT1A基因在大豆種子發(fā)育中期高量表達(dá)。可見外源基因VgDGAT1A已經(jīng)在大豆中穩(wěn)定高效表達(dá)。

圖2　qRT-PCR檢測大豆種子發(fā)育中期VgDGAT1A基因表達(dá)Fig.2　Expression of VgDGAT1A gene by qRT-PCR during mid-period of soybean seed mature process. 注：“Jack”為野生型大豆，“1～4”為轉(zhuǎn)VgDGAT1A大豆不同品系Note:“Jack” represents wild-type soybean and "1～4" represents transgenic VgDGAT1A different soybean lines

2.3　VgDGAT1A轉(zhuǎn)基因大豆種子總油脂含量分析

對7個VgDGAT1A轉(zhuǎn)基因大豆品系和非轉(zhuǎn)基因的野生型大豆Jack大豆種子油脂含量測定結(jié)果(圖3)顯示，轉(zhuǎn)VgDGAT1A基因大豆與野生型(Jack)品種相比，總脂含量均有明顯提高(4%～9%)，平均提高了5.1%。檢測結(jié)果表明，外源VgDGAT1A基因轉(zhuǎn)入大豆并高效表達(dá)，編碼形成的DGAT1酶蛋白能正常行駛功能，且顯著增加大豆總油脂(TAG)含量。觀察轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因大豆種子形態(tài)，未見差異(圖4)。

圖3　轉(zhuǎn)VgDGAT1A大豆與野生型Jack種子油含量Fig.3　Content of seed oil of transgenic and wild-type Jack seed注：“Jack”為野生型大豆，“1～7”為轉(zhuǎn)VgDGAT1A大豆不同品系。Note:"Jack"representy wild-type soybean,"1～7" represents transgenic VgDGAT1A different soybean lines.

圖4　轉(zhuǎn)VgDGAT1A大豆與野生型Jack種子表型對比Fig.4　Comparison of phenotypes of seeds of VgDGAT1A and wild type seeds of Jack

3　討論與結(jié)論

早前研究表明，DGAT表達(dá)與大豆種子油脂積累速率之間表現(xiàn)出強(qiáng)烈的正相關(guān)性[13]。在發(fā)育的種子中，DGAT活性的逐漸增強(qiáng)引發(fā)了油脂快速積累，DGAT活性逐漸降低的同時油脂含量也逐步穩(wěn)定[14]。油菜BnDGAT1超表達(dá)能顯著提高種子總脂肪酸含量[15]。對蓖麻 DGATs 的研究表明，在蓖麻種子油脂的累積高峰期，DGAT1活性增強(qiáng)，油脂含量顯著增加[16]。本文對VgDGAT1A轉(zhuǎn)基因大豆陽性植株鑒定表明，經(jīng)過多年種植，高代轉(zhuǎn)VgDGAT1A基因大豆仍然呈現(xiàn)整合的VgDGAT1A基因穩(wěn)定遺傳。qRT-PCR分析表明，VgDGAT1A基因在大豆種子發(fā)育中期的表達(dá)量高，VgDGAT1A基因編碼的DGAT1亦可正常行使功能，促進(jìn)TAG合成，導(dǎo)致轉(zhuǎn)VgDGAT1A基因大豆種子含油量顯著提高。本文對高代轉(zhuǎn)VgDGAT1A基因大豆種子表型檢測與分析，再次證實(shí)VgDGAT1A是一個優(yōu)異的提高種子含油量的基因，亦可用于其他油料作物油脂含量和品質(zhì)的遺傳改良。

植物油脂代謝是一個由多基因參與的，涉及各蛋白酶協(xié)同表達(dá)和共同運(yùn)作的高度精密調(diào)控的生化過程。Vanhercke 觀察到當(dāng)DGAT1和WRI1共同浸入本氏煙草葉中時，對TAG積累有顯著的協(xié)同效應(yīng)，在煙草中通過WRI1與DGAT1 基因協(xié)同表達(dá)，在油脂含量提升的同時，脂肪酸成分也出現(xiàn)變化，多不飽和脂肪酸含量下降，同時單不飽和脂肪酸含量上升[17]。丁健等發(fā)現(xiàn)沙棘果肉高油脂積累源于源基因“GPD1”和匯基因“DGAT1和DGAT2”的協(xié)同高表達(dá)[18]。崔琴琴發(fā)現(xiàn)FAD2和DGAT2共表達(dá)能夠提高油桐的含油量，同時少量提高亞油酸含量[19]。各種油料作物的DGAT基因研究的逐漸深入，以及更多與植物油脂代謝相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)，對提高植物油產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。