霍俊偉，薛曉曉，秦　棟，劉慶帥，劉化禹，謝佳璇，孫小娟，員盎然，陶　韜

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，哈爾濱　150030）

藍(lán)果忍冬（Lonicera caerulea L.）為忍冬科（Capri?foliaceae）忍冬屬（Lonicera）小漿果，俗稱藍(lán)靛果，我國大小興安嶺、長白山山區(qū)野生資源豐富[1]。果實富含花色苷類、黃酮類及多酚類等生物活性物質(zhì)，氨基酸、糖類、有機酸、礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，具有較高營養(yǎng)和醫(yī)療保健價值[2]，可預(yù)防癌癥、心血管、糖尿病等疾病[3]。

實際生產(chǎn)中藍(lán)果忍冬品種相對單一，缺乏優(yōu)質(zhì)苗木，難以滿足市場需求，提高育種效率，培育具有不同特點新品種，建立藍(lán)果忍冬組培快繁體系尤為必要。以離體再生技術(shù)為基礎(chǔ)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)可提高育種效率，拓寬育種途徑，加快苗木繁育。愈傷組織誘導(dǎo)是建立離體再生體系必要步驟，也是研究藍(lán)果忍冬活性成分基礎(chǔ)。

目前，藍(lán)果忍冬組織培養(yǎng)和離體再生方面研究主要包括兩方面：一是以帶芽莖段、腋芽、莖尖等為外植體建立組培快繁體系，探索各培養(yǎng)階段適合生長調(diào)節(jié)劑比例、合適基本培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件等[4-5]。二是以莖段和葉片誘導(dǎo)愈傷組織建立再生體系[6-7]。

植物生長調(diào)節(jié)劑可影響外植體內(nèi)源激素水平，促進(jìn)離體器官生長和愈傷組織形成[8]。忍冬屬植物愈傷組織誘導(dǎo)可用BA、KT、IAA、NAA、2,4-D等，如單獨添加2,4-D各處理均可誘導(dǎo)金銀花葉片產(chǎn)生愈傷組織，以1.0 mg·L-1最佳，添加KT可改善愈傷組織狀態(tài)，提高誘導(dǎo)率，不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MB+2.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1IBA[9]。細(xì)胞分裂素和生長素配合使用可有效誘導(dǎo)產(chǎn)生多種植物愈傷組織，但細(xì)胞分裂素濃度不易過高。MS培養(yǎng)基添加1.0 mg·L-1NAA和0.1 mg·L-16-BA可誘導(dǎo)藍(lán)果忍冬莖尖、莖段、葉片產(chǎn)生愈傷組織，誘導(dǎo)率最高達(dá)86.7%[6-7]。4.4 μmol·L-16-BA與2.26 μmol·L-12,4-D配比可有效誘導(dǎo)灰毛氈忍冬葉片產(chǎn)生愈傷組織，誘導(dǎo)率達(dá)86.7%[10]。CPPU、TDZ、ZT也廣泛應(yīng)用于愈傷組織誘導(dǎo)[11]，均具有高活性，誘導(dǎo)效率較高。CPPU在誘導(dǎo)苧麻產(chǎn)生愈傷組織時活性高于6-BA，再生效率更高[11]。非洲菊葉片愈傷組織誘導(dǎo)選用2 mg·L-1TDZ結(jié)合0.05 mg·L-12,4-D，培養(yǎng)15 d出愈率達(dá)80%以上，愈傷組織增殖培養(yǎng)則減小TDZ濃度[12]。TDZ也有負(fù)面作用，TDZ添加使花楸外植體褐化[13]。ZT是天然植物激素，可用于藍(lán)莓組培快繁與再生[14]。此外KT、TDZ、ZT、6-BA等細(xì)胞分裂素相互組合再結(jié)合生長素類對某些植物誘導(dǎo)效果良好，6-BA 0.3 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1基礎(chǔ)上添加KT 0.2 mg·L-1有利于江南牡丹莖段愈傷組織分化[15]。MS+BA 1.0 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1有利于紅掌葉片愈傷組織分化[16]。

本文針對藍(lán)果忍冬組培快繁技術(shù)選擇不同消毒條件組合探討組培成活率[17]，藍(lán)果忍冬愈傷組織誘導(dǎo)中未見使用CPPU、TDZ、ZT及幾種生長調(diào)節(jié)劑組合處理，不同生長調(diào)節(jié)劑對藍(lán)果忍冬葉片愈傷組織誘導(dǎo)影響未見報道。

本試驗選用兩個引自俄羅斯藍(lán)果忍冬鮮食品種為試材，通過培養(yǎng)無菌苗，采取葉片，添加一種和多種生長調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)葉片愈傷組織，以期為藍(lán)果忍冬葉片再生體系建立奠定基礎(chǔ)，為組培快繁研究提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料及培養(yǎng)

試驗于2017～2018年在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院完成，以兩個引自俄羅斯鮮食品種邱雷姆和娜雷姆為試材，MS培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)30 d，取無菌苗中上部葉片，接種時在葉片正面橫切形成劃痕，葉片背面接觸培養(yǎng)基，接種到添加蔗糖30 g·L-1，瓊脂7 g·L-1，pH 5.8，附加不同生長調(diào)節(jié)劑MS培養(yǎng)基，于人工氣候室暗培養(yǎng)相應(yīng)時間后轉(zhuǎn)移至光下培養(yǎng)，培養(yǎng)40 d。暗培養(yǎng)條件為濕度75%，溫度（25±1）℃。

1.2　試驗處理及方法

1.2.1單一植物生長調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)葉片愈傷組織

以兩品種無菌苗葉片為材料，以MS為基本培養(yǎng)基，選用6-BA、2,4-D、TDZ、ZT和CPPU 5種激素設(shè)計單因素試驗，濃度均為0.5、1.0、2.0 mg·L-1。暗處理15 d后置于光下培養(yǎng)。葉片經(jīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)40 d后觀察愈傷組織誘導(dǎo)情況。

1.2.2兩種植物生長調(diào)節(jié)劑組合誘導(dǎo)葉片愈傷組織

選用6-BA和2,4-D激素組合，TDZ和ZT激素組合，設(shè)計兩個復(fù)因素試驗：暗處理15 d后置于光下培養(yǎng)。葉片在培養(yǎng)基培養(yǎng)40 d后觀察愈傷組織誘導(dǎo)情況。

6-BA設(shè)2個水平：1.0、2.0 mg·L-1；2,4-D設(shè)3個水平：0.2、0.5、1.0 mg·L-1設(shè)計6個水平組合完全隨機試驗。TDZ設(shè)2個水平：1.0、2.0 mg·L-1；ZT設(shè)3個水平：0.1、0.3、1.0 mg·L-1設(shè)計6個水平組合完全隨機試驗。

1.2.33種植物生長調(diào)節(jié)劑組合誘導(dǎo)葉片愈傷組織

MS培養(yǎng)基中添加6-BA（0.5、1.0、1.5 mg·L-1），IBA（0.1、0.2、0.3 mg·L-1）和KT（0.5、1.0、1.5 mg·L-1），采用3因素3水平正交設(shè)計，按照L9（34）前3列安排試驗，共9個處理組合（見表1）。暗處理35 d，統(tǒng)計出愈率，褐化率，觀察愈傷組織狀態(tài)。

1.3　數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

出愈率（%）=愈傷組織數(shù)/外植體數(shù)×100%，褐化率（%）=褐化葉片數(shù)/外植體數(shù)×100%。

所有試驗均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析及作圖采用SPSS 19.0和Excel 2007軟件。

表1　藍(lán)果忍冬葉片愈傷組織誘導(dǎo)正交設(shè)計Table 1　Orthogonal design of the blue honeysuckle leaves callus induction （mg·L-1）

2　結(jié)果與分析

2.1　單一植物生長調(diào)節(jié)劑對葉片愈傷組織誘導(dǎo)影響

添加不同單一生長調(diào)節(jié)劑對藍(lán)果忍冬葉片愈傷組織誘導(dǎo)效果不同。2,4-D、ZT、CPPU誘導(dǎo)葉片產(chǎn)生愈傷組織，但添加6-BA和TDZ無法誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織（數(shù)據(jù)未列出）；2,4-D、ZT、CPPU可誘導(dǎo)葉片產(chǎn)生愈傷組織，但出愈率和愈傷組織顏色、質(zhì)地等差異較大（見表2～4，圖1）。

3種調(diào)節(jié)劑中以2,4-D誘導(dǎo)效果最好，邱蕾姆和娜蕾姆出愈率均達(dá)90%以上，當(dāng)2,4-D濃度達(dá)1.0 mg·L-1以上時，出愈率達(dá)100%；ZT和CPPU誘導(dǎo)率較低，ZT處理僅誘導(dǎo)邱雷姆出現(xiàn)少量愈傷組織，濃度2.0 mg·L-1處理下，邱雷姆葉片出愈率僅為13%，且愈傷組織呈黃色或棕褐色（見圖1I～L），量極少，易褐化，污染嚴(yán)重，娜雷姆無愈傷組織產(chǎn)生且褐化污染嚴(yán)重。CPPU處理組誘導(dǎo)效果稍優(yōu)于ZT處理，邱雷姆0.5、2.0 mg·L-1處理均可產(chǎn)生愈傷組織，出愈率分別為15%、21%，娜雷姆僅2.0 mg·L-1時有愈傷組織出現(xiàn)，出愈率為15%，同樣量少易褐化，污染嚴(yán)重。3種調(diào)節(jié)劑相比，ZT和CPPU啟動葉片產(chǎn)生愈傷組織時間長，出愈率低且有褐化和污染現(xiàn)象，不適合作藍(lán)果忍冬葉片愈傷組織誘導(dǎo)劑。

2,4-D誘導(dǎo)愈傷組織形態(tài)復(fù)雜。接種一周劃痕處出現(xiàn)顆粒狀突起，愈傷啟動，接種10 d葉片劃痕處形成淡黃色透明愈傷組織（見圖1A）。隨后5 d暗培養(yǎng)，愈傷組織快速增大，將愈傷組織轉(zhuǎn)移至光周期16 h/8 h光下培養(yǎng)，愈傷組織漸漸轉(zhuǎn)綠，部分愈傷組織質(zhì)地變硬，部分愈傷組織顏色變?yōu)橄≤浖t棕色（見圖1B～H）。隨2,4-D濃度升高，邱雷姆愈傷量先增后減，娜雷姆愈傷量先減后增（見表2）。

從愈傷量比較，邱雷姆2,4-D濃度1.0 mg·L-1時誘導(dǎo)效果最佳，娜雷姆2,4-D濃度2.0 mg·L-1時誘導(dǎo)效果最佳。若考慮愈傷組織后續(xù)再生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，則娜雷姆選2,4-D濃度0.5 mg·L-1時較好，此濃度下愈傷組織致密緊實，呈顆粒狀，有利于不定芽再生。

2.2　添加兩種植物生長調(diào)節(jié)劑對葉片愈傷組織誘導(dǎo)影響

由圖2、表5、6可知，不同生長調(diào)節(jié)劑組合對藍(lán)果忍冬葉片愈傷組織誘導(dǎo)效果不同。6-BA與2,4-D各組合均可有效誘導(dǎo)葉片產(chǎn)生愈傷組織，但TDZ和ZT組合誘導(dǎo)率極低，僅邱雷姆出現(xiàn)少量愈傷且呈黃棕色，易褐化（見圖2J）。

6-BA與2,4-D組合各處理誘導(dǎo)率均可達(dá)100%，且愈傷組織多呈綠色、黃綠色、深綠色或淡黃色，表面有瘤狀突起，顆粒狀，質(zhì)地緊實，愈傷量多，愈傷組織生長快，無褐化（見圖2A～F）。這與單獨添加2,4-D誘導(dǎo)的愈傷組織有差異，可能是細(xì)胞分裂素與生長素相互作用結(jié)果。各處理愈傷量略有差異，當(dāng)6-BA濃度為1.0 mg·L-1時，邱雷姆葉片愈傷量隨2,4-D濃度升高而增多，娜雷姆愈傷量則先增后減，2,4-D濃度0.5 mg·L-1時愈傷量達(dá)最多，但少于邱雷姆。6-BA濃度為2.0 mg·L-1時，兩品種均在2,4-D濃度0.5 mg·L-1時達(dá)最大愈傷量。各處理娜雷姆愈傷量少于邱雷姆，原因是品種差異所致。

表2　2,4-D對葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 2　Effect of 2,4-D on callus induction of leaf

表3　ZT對葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 3　Effect of ZT on callus induction of leaf

表4　CPPU對葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 4　Effect of CPPU on callus induction of leaf

圖1　2,4-D、ZT、CPPU誘導(dǎo)的葉片愈傷組織Fig.1　Leaf callus induced by 2,4-D,ZT and CPPU

表5　6-BA與2,4-D組合對葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 5　Effect of combination of growth regulators(6-BA,2,4-D)on callus induction of leaf

表6　TDZ與ZT組合對葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 6　Effect of combination of growth regulators(TDZ,ZT)on callus induction of leaf

圖2　兩種生長調(diào)節(jié)劑組合誘導(dǎo)的愈傷組織Fig.2　Leaf callus induced by a combination of two growth regulators

2.3　添加3種植物生長調(diào)節(jié)劑對葉片愈傷組織誘導(dǎo)影響

3種調(diào)節(jié)劑6-BA、IBA、KT的9種組合處理對藍(lán)果忍冬不同品種葉片愈傷組織誘導(dǎo)效果不同（見表7），方差分析表明，影響邱雷姆葉片愈傷組織誘導(dǎo)主次因素為IBA＞6-BA＞KT，影響娜雷姆葉片愈傷組織誘導(dǎo)主次因素為KT＞IBA＞6-BA（見表8～9）。兩品種存在差異，可能與不同品種對細(xì)胞分裂素敏感性有關(guān)。MS+6-BA 1.0 mg·L-1+IBA 0.3 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-（1處理6）對兩品種誘導(dǎo)率均達(dá)95%以上，可作為通用體系。

3種調(diào)節(jié)劑組合各處理誘導(dǎo)的愈傷組織形態(tài)基本相同，均為黃色顆粒狀，質(zhì)地較硬（見圖3）。結(jié)合表7和圖3，從誘導(dǎo)率、愈傷量或褐化比較，邱雷姆誘導(dǎo)效果均好于娜雷姆，可能與品種差異有關(guān)。

表7　6-BA、IBA、KT組合對葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 7　Effect of combination of growth regulators(6-BA,IBA,KT)on callus induction

表8　娜雷姆葉片愈傷誘導(dǎo)率結(jié)果方差分析Table 8　ANOVE analysis result of leaf callus induction rate in Nareim

表9　邱雷姆葉片愈傷誘導(dǎo)率結(jié)果方差分析Table 9　ANOVE analysis result of leaf callus induction rate in Qiuleimu

圖3　3種生長調(diào)節(jié)劑組合誘導(dǎo)的愈傷組織Fig.3　Leaf callus induced by a combination of three growth regulators

2.4　3種不同添加方式對藍(lán)果忍冬葉片愈傷組織誘導(dǎo)比較

通過圖1～3愈傷組織形態(tài)對比及表2、5、7數(shù)據(jù)對比，不同方法愈傷組織誘導(dǎo)效果不同。添加單一生長調(diào)節(jié)劑，2,4-D是誘導(dǎo)藍(lán)果忍冬葉片產(chǎn)生愈傷組織最有效物質(zhì)，濃度范圍0.5～2.0 mg·L-1均有效，6-BA、TDZ、ZT、CPPU效果較差。

添加兩種調(diào)節(jié)劑處理優(yōu)于單一調(diào)節(jié)劑處理，2,4-D處理各濃度下出愈率均為100%，但愈傷組織質(zhì)地多為淡黃色或綠色水漬狀，較軟，而2,4-D和6-BA配合處理下愈傷組織顏色多為綠色顆粒狀，質(zhì)地緊實致密，有利于后期培養(yǎng)和不定芽誘導(dǎo)，且愈傷量高于2,4-D單獨處理。

6-BA、IBA、KT3種調(diào)節(jié)劑組合誘導(dǎo)率低于2，4-D和6-BA組合處理，且愈傷啟動時間長，愈傷組織生長緩慢，該方案兩個品種誘導(dǎo)效果差異較大，娜雷姆誘導(dǎo)率低，最低為處理4（59%），結(jié)果見表7。愈傷量很少且褐化率高（見圖3F），邱雷姆愈傷量較多（見圖3A～C），與單獨添加2,4-D及添加6-BA和2,4-D組合處理誘導(dǎo)的愈傷量相當(dāng)，但質(zhì)地更為緊實，相反6-BA和2,4-D組合處理則更加松脆（見圖2～3）。

3　討論

早熟禾種子單獨添加2,4-D即可誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，1.0～2.0 mg·L-1誘導(dǎo)效果較好[18]，0.1或0.2 mg·L-12,4-D與3 mg·L-16-BA組合誘導(dǎo)效果明顯優(yōu)于2,4-D單獨處理。本試驗結(jié)果表明，邱雷姆和娜雷姆分別在2,4-D濃度1.0和2.0 mg·L-1時誘導(dǎo)效果最佳，且6-BA與2,4-D組合處理優(yōu)于2,4-D單獨處理。與丁路明等研究結(jié)果類似。

一般高濃度2,4-D不利于愈傷組織誘導(dǎo)分化[19]，黑果枸杞愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS＋2,4-D 2.0 mg·L-1＋6-BA 0.5 mg·L-1，愈傷組織分化培養(yǎng)基為MS＋2,4-D 1.0 mg·L-1＋6-BA 0.5 mg·L-1，即低濃度2,4-D利于分化[20]，本研究結(jié)果表明，娜雷姆在2,4-D濃度0.5 mg·L-1時，愈傷組織更為致密，有利于愈傷組織進(jìn)一步分化。單獨使用6-BA無法誘導(dǎo)杜仲葉片產(chǎn)生愈傷組織，6-BA與生長素NAA配合使用可誘導(dǎo)產(chǎn)生較好愈傷組織[21]。本研究結(jié)果表明，單獨添加6-BA時葉片愈傷組織誘導(dǎo)率為0，但與生長素2,4-D結(jié)合效果較好，表明細(xì)胞分裂素類和生長素類配合使用愈傷組織誘導(dǎo)效果更好。

單獨添加細(xì)胞分裂素6-BA、TDZ、CPPU均可誘導(dǎo)毛桃葉片產(chǎn)生愈傷組織[22]。1.0 mg·L-1ZT可誘導(dǎo)矮叢藍(lán)莓莖段直接器官再生，5.0 mg·L-1ZT可誘導(dǎo)外植體通過愈傷組織途徑再生[14]。本研究結(jié)果表明，CPPU、TDZ、ZT雖然活性較高，但對藍(lán)果忍冬葉片愈傷組織誘導(dǎo)效果不佳，可能與物種不同有關(guān)。本研究表明該組合效果較差，不適于藍(lán)果忍冬離體誘導(dǎo)及再生。

曹磊等研究表明，在6-BA與生長素NAA組合基礎(chǔ)上添加KT，金鐵鎖帶芽莖段出愈率和芽叢分化率均高達(dá)100%[23]。本研究采用6-BA、2,4-D、KT組合處理時兩品種誘導(dǎo)率均達(dá)60%以上，且邱雷姆在大部分處理下誘導(dǎo)率為100%，說明KT對藍(lán)果忍冬愈傷組織誘導(dǎo)效果顯著。

利用葉片作愈傷組織誘導(dǎo)具有取材廣，效率高等特點，提高苗木快繁效率，是離體再生體系建立基礎(chǔ)。本試驗探討不同生長調(diào)節(jié)劑對葉片愈傷組織的誘導(dǎo)，由愈傷組織到可實際應(yīng)有的完整植株，還需經(jīng)愈傷組織分化不定芽及生根培養(yǎng)、煉苗移栽等多個環(huán)節(jié)。